Пузыреплодник диабло: Купить Пузыреплодник Диабло Physocarpus opulifolius Diabolo

уход, обрезка весной, место в ландшафтном дизайне + фото

Сорта с красными листьями

Краснолистные кустарники пузыреплодника разнообразны по форме куста и оттенкам листвы. Наибольшую популярность приобрели следующие сорта:

Diabolo (Диаболо)

Пузыреплодник сорт Диаболо

Могущественные кустарники этого сорта пузыреплодника, если пустить их рост на самотек, могут достигать в высоту 3,5 метров, а в ширину – 2 метров. Несмотря на то, что ветви у растения тонкие, не превышающие 1 сантиметра в диаметре, они отличаются высокой плотностью посадки листвы. Множество листиков темно-бордового цвета имеют эллиптическую форму. Глядя на них, кажется, что они устремлены своими заостренными кончиками исключительно в сторону солнца. Нарядная листва осенью меняет свой цвет на желтый, не менее праздничный.

Summer Wine (Саммер вайн)

Пузыреплодник сорт summer wine

Кустарник с раскидистыми ветвями покрывает яркая листва, своим цветом напоминающая красное крепленое вино.

Форма куста и цвет листьев создают необыкновенный эффект. Со стороны они напоминают картину винных брызг или праздничного салюта. Ветви растения достаточно крепкие, в диаметре достигают 1,5 – 2 сантиметра. Кора расслаивающаяся, коричневая. Цветет этот сорт пузыреплодника весной, плотно покрываясь бело-розовыми соцветиями. Сорт хорошо переносит сильные морозы, поэтому на территории России его можно выращивать практически во всех регионах.

Red Baron (Ред Барон)

Пузыреплодник ред барон

Этот сорт пузыреплодника имеет красивую полушаровидную форму кроны. Высота и ширина взрослого растения практически одинакова: 2 метра в высоту и столько же в ширину. Во время цветения кусты покрываются бело-розовыми соцветиями. Темно-красные листья, гофрированные по жилкам, имеют вытянутую форму.  Осенью они меняют свой цвет на бронзовый.

Schuch (Шух)

Пузыреплодник шух

Кустарники этого сорта пузыреплодника достигают 2 метров в высоту. Ветви с красно-коричневой корой покрыты темно-красной листвой и устремлены вверх. Осенью цвет листьев остается неизменным.

Ledi in Red (Леди ин Ред)

Пузыреплодник Леди ин ред (Lady in Red)

Название «Дама в красном» говорит само за себя. Этот сорт пузыреплодника вырастили английские селекционеры. Кусты красивой формы не превышают полутора метров в высоту. Нарядная листва ярко-красного цвета к осени становится более темной.

Это, безусловно, неполный список краснолистных сортов пузыреплодника. Но они являются одними из самых популярных среди европейских специалистов по ландшафтному дизайну. Их красоту, неприхотливость, простоту размножения успели оценить и наши садоводы.

Пузыреплодники-хамелеоны

Хамелеонами называют сорта пузыреплодника калинолистного, которые меняют свой окрас в течение вегетативного сезона. Среди них есть разновидности с однотонной расцветкой и растения, чья листовая пластина окрашена как минимум в два цвета.

Энис Голд

Пузыреплодник Энис Голд – нарядный пестролистный сорт компактных размеров.

Он редко вырастает выше 1,2-1,5 м, в ширину растение достигает также примерно до 1,4-1,5 м. Отличительной чертой разновидности является двойной окрас листовой пластины. Желто-зеленые листья будто покрыты пятнами, которые складываются в интересную мозаику.

Несмотря на традиционный зеленый окрас, кустарник выглядит нарядно из-за сочетания темных и светлых тонов

Копертинна

Копертинна – разновидность, выведенная в ходе селекционных работ на основе сортов Дартс Голд и Дьяболо. Высота пузыреплодника калинолистного Копертинна может достигать 1,5-2,5 м. Листва кустарника оранжевого цвета, однако, летом она становится темно-красной, приближаясь к коричневым тонам. Цветки у Копертинны поначалу белые, но через некоторое время они розовеют.

Декоративности сорту Копертинна придает красноватый окрас побегов

Эмбер Джубили

Эмбер Джубили – калинолистный пузыреплодник британского происхождения. Крона у растения довольно плотная, компактная, около 1,3-1,5 м в диаметре. На протяжении всего вегетационного периода окраска листвы постепенно переходит от желтовато-пурпурных тонов к салатовым. Осенью она становится оранжево-бронзовой.

Сорт Эмбер Джубили отличается приятным кирпичным окрасом листвы

Chameleon

Пузыреплодник Хамелеон – это достаточно компактный калинолистный сорт с необычным окрасом листвы. У молодых кустов листовая пластина имеет пурпурную окантовку по самому краю, однако, с течением времени она становится салатовой. Основной цвет листьев – зеленовато-коричневый. Лепестки цветков у этой разновидности кремово-белые.

Высота растения составляет в среднем 1-1,5 м.

У основания листья сорта Хамелеон иногда окрашены в красный цвет

Правила ухода

Декоративные формы культуры высаживают только на открытом участке, в тени окраска кроны будет тусклой, приближенной к зеленому цвету. Почвы должны быть плодородными, с нейтральной или слабокислой реакцией. Агротехника пузыреплодника самая простая:

• весной проводят санитарную обрезку, после цветения убирают стебли, выходящие за периметр кроны, осенью растение прореживают и придают форму;
• подкармливают органикой в начале вегетации, осенью комплексным минеральным удобрением;
• поливают. Чтобы не допустить пересыхание грунта и его переувлажнения, ориентируются на погоду;
• проводят профилактику грибковой инфекции. Опрыскивают весной и осенью бордоской жидкостью.

На зиму прикорневой круг закрывают соломой или хвоей, весной как элемент ландшафтного дизайна используют в качестве мульчи разноцветную древесную щепу или любой декоративный материал.

Описание кустарника

Пузыреплодник распространен в Восточной Азии и в Северной Америке. Ареал произрастания охватывает различные климатические условия. Растение представлено примерно 15 видами, которые имеют характерные отличительные особенности. Отдельно в роде выделяются декоративные виды, которые отличаются эстетичным внешним видом и особыми свойствами, проявляющимися в процессе развития. Это может быть расцветка растения, отдельный характерный рисунок.

В процессе развития куст достигает достаточных размеров для декоративных задач. Он довольно раскидистый, а тонкие ветви его постепенно склоняются, создавая густую и красивую крону.

Листья имеют длину до 6-7 сантиметров и разделен на 3-5 лопастей. Цвет листву определяется освещением и временем года. Так, произрастание в затемненном месте приводит к образованию зеленых листьев, имеющих пурпурный оттенок. На солнечном участке же наоборот – цвет достигает даже черного оттенка.

Кстати, особенность и привлекательность куста, которая определяется необычными оттенками, вызвана нарушением в процессе образования хлорофилла. Благодаря природной ошибке и нарушению синтеза куст имеет привлекательные цвета и декоративную ценность. Так недостаток стал важнейшим достоинством. Кора кустарника имеет темно-бордовый окрас, а по мере взросления растения приобретает коричневый оттенок. В начале лета пузыреплодник Диаболо расцветает, равномерно покрываясь розовыми цветами. Некоторые садоводы могут посчитать образовавшиеся цветки недостаточно привлекательными, но тем не менее они очень нежные и ароматные. Процесс цветения занимает 2-3 недели, а в отдельных случаях цветение может растянуться до 2 месяцев.

Такая продолжительность делает его наиболее долгоцветущим кустарником.

Если на них надавить, что пузырьки взрываются с характерным щелканьем. И вот это свойство дало название пузыреплоднику. В летний период листовки имеют зеленый цвет. Как только они достигают созревания, то приобретают характерный красно-коричневый цвет. Эти плоды покрывают кустарника даже в большем количестве, чем цветы. Эти плоды полностью созревают в первые недели осени, после чего долгое время сохраняются на кустарнике.

Также декоративная ценность пузыреплодника связана с длительностью развития на одном месте, которая может достигать 50 лет. Иными словами, единожды разведя кустарник на участке вы сможете получать красивое растение, украшающее территорию, на протяжении половины столетия. И еще – высота кустарника достигает 3,5 метров.

Мероприятия по уходу за пузыреплодником

Посадка и уход за пузыреплодником калинолистным – несложный комплекс мероприятий, но требующий определенных знаний.

Представитель семейства Розовые, как и любое растение, имеет определенный нюансы, которые должны быть соблюдены садоводом при культивировании. При соблюдении рекомендаций можно наблюдать, как быстро растет пузыреплодник калинолистный, прибавляя ежегодно до 40 сантиметров в ширину и высоту. В число обязательных мероприятий по уходу входит:

• обрезка кустарника;
• полив растения;
• внесение подкормки.

Обрезка кустов пузыреплодника калинолистного

Проведение своевременной обрезки кустарника является одним из основополагающих факторов быстрого роста и здоровья растения. Все виды и сорта пузыреплодника положительно реагируют на мероприятия по уходу. Кроме практического значения обрезка помогает сформировать плотную, аккуратную крону желанной формы и позволяет представителю царства растений стать достойным украшением дачного участка, успешно выполнять декоративную функцию.

Санитарную обрезку проводят в весенний период. При необходимости мероприятие выполняют летом и осенью. Сигналом к началу служит внешний вид кустарника. При наличии поломанных или поврежденных веток их необходимо своевременно удалить.

Формовочная процедура проводится только после периода цветения. Допустимо сокращать длину ветвей максимум на половину размера кроны в первый год жизни растения. В последующий период удаляемый участок увеличивают до 2/ 3 от общей длины.

При формировании и поддержании в достойном виде живой изгороди следует заниматься обрезкой кроны несколько раз за период вегетации. Частота может меняться в зависимости от состояния кустарника. Первая процедура по формированию изгороди проходит в середине весны и длится до начала периода цветения.

Обрезку с целью омоложения растения рекомендуют проводить в осенний период или в начале весны. Старые ветки срезают у самого основания, а остальные срезают до точки отхождения боковых побегов.

Организация режима полива пузыреплодника

Для правильного полива представителя царства растений необходимо учитывать особенности зоны культивирования – состав почвы и климатические условия, возраст кустарника.

При выращивании пузыреплодника калинолистного в районах засушливого климата с жарким летом и высокими средними показателями температур поливу придется уделить больше внимания. Песчаные или суглинистые почвы потребуют регулярного полива в течение всего вегетационного периода. Рекомендовано производить мероприятие по поливу от двух раз в 7-10 дней в количестве 40-50 литров воды. Производить полив следует под корень. При попадании влаги на листву высока вероятность ожогов. Во избежание травмирования растения следует проводить процедуру полива в утренние или верчение часы.

При культивировании растения в глинистых почвах или на газонах следует проявить осторожность. Регулярность процедуры значительно сокращается

Необходимо строго соблюдать меру. Избыточное количество воды приведет к мучнистой росе и последующей гибели пузыреплодника.

Подкормка растения

Пузыреплодник требует подкормки два раза в год. Мероприятия проводят в сентябре или мае месяце. Весной для улучшения скорости роста следует вносить азотосодержащие соединения. В качестве питательных веществ подойдут следующие вещества:

• аммиачная селитра;
• коровяк органический;
• мочевина.

Для подготовки подкорма следует смешать килограмм органического вещества, 10 л простой воды, 1-2 столовых ложек смеси селитры и мочевины.

В осенний период для подкорма выбирают нитроаммофоску. Для приготовления соединяют столовую ложку удобрения и 10 л воды. Для подкормки взрослого растения следует внести 2-3 ведра питательной смеси.

Способы размножения пузыреплодника калинолистного

После посадки, есть несколько вариантов размножить кустарник, самые удачные – черенками и отводками.

Отводками размножать просто, потому что для укоренения не нужно ничего нарезать и готовить. Брать нужно длинный побег, растущий из внутренней части куста, снизу. Убирать листья следует не со всего участка, а оставить несколько на кончике.

Подготовленную ветвь укладывают в траншею, глубиной 150 мм, и придавливают скобами. Делать это нужно в начале весны, а отсаживать растение только на следующий год.

Еще один способ увеличить количество кустов – это деление. Самое подходящее время – весна, чем раньше, тем лучше. Выкапывать нужно сильный куст, и острым ножом отделить меньшую часть вместе с корнями. Саженец опускают в раствор марганца, для обеззараживания среза. Посадка производится таким же способом, как и цельного саженца без земляного кома.

Пока укоренение не произошло, важно поддержать влажность почвы, в дальнейшем корни будут питаться осадками

Ухаживать за пузыреплодником нужно, чтобы поддерживать его декоративный вид. В диких условиях кустарник может жить до четверти века без человеческого участия.

В засушливый период лета, в особенности на глинистых почвах пузыреплодник диабло важно поливать, из такой тяжелой почвы без дождей сложно добить влагу корням. Вода нужна максимум пару раз в неделю при таких условиях

Поливать нужно в утренние или вечерние часы, чтобы солнце не сушило крону.

В начале весны, для удобрения воду разводят с птичьим пометом, или делают компостную жижу. Можно применять мочевину и селитру. Осенью поливать можно растворенной в воде золой или комплексным средством.

Распространенные формы и сорта

Один из моих любимых декоративных кустарников – это пузыреплодник калинолистный. За что я его люблю?

Пузыреплодник представляет собой кустарник высотой до 3 м со слегка раскидистыми поникающими ветвями, образующими густую полушаровидную крону. В культуре с 1864 года. Имеет несколько декоративных форм, различающихся окраской листьев. Ухаживать за пузыреплодником просто.

Его декоративность захватывает весь вегетационный период, от момента распускания почек до листопада. Все это время я любуюсь его листвой, цветами и плодами. Разные сорта красивы по-своему!  Теперь поговорим о сортах.

Диаболо

Кустарник высотой до 3 м с ровной интенсивно­пурпурной окраской листьев в течение всего сезона. В отдельные моменты вегетации и в разных частях кроны в окраске листьев могут присутствовать красные, свекольные, коричневые и фиолетовые оттенки; форма куста фонтанообразная. Многочисленные бледно­розовые цветки собраны в соцветия до 5 см в диаметре.

Это быстрорастущий, цветущий кустарник с раскидистой густой кроной высотой и диаметром около 3 м. Листья у растений, высаженных на солнечных участках, темно-пурпурные. При выращивании кустарника в тени его листья имеют зеленый цвет с легким красновато-коричневым оттенком. Пузыреплодник Диабло прекрасно подойдет для создания пестрых живых изгородей.

Фото: пузыреплодник Диаболо

Дартс Голд

Кустарник высотой до 1,5 м с золотистой листвой, сохраняющей свою яркость весной и летом, осеньюлистья приобретают окраску наподобие кожуры лайма;  форма плотного куста куполовидная. Цветки многочисленные белые или слегка розоватые. 

Высота этого раскидистого кустарника – до 1,5 м, диаметр кроны такой же. Листья лимонно-желтые, в течение сезона меняют окраску до оранжевой и золотистой. Особенно эффектно будет смотреться рядом с растениями с темными листьями.

Фото: пузыреплодник Дартс Голд

Лютеус (или Ауреус)

быстрорастущий кустарник высотой до 3 м, при распускании его желтые листья имеют оранжевый оттенок; летом они зеленеют, а осенью опять желтеют. Цветет белыми цветками, которые в августе – сентябре превращаются в плоды. 

Фото: пузыреплодник Лютеус

Ред Барон

Компактный кустарник высотой до 2 м с выразительной роскошной темно­красной окраской листьев, которые немного уже, чем у сорта Диаболо. Цветки белые с розовым оттенком, собранные в зонтичные соцветия диаметром до 5 см. Дает интересный колоритный акцент в приусадебных садах. Ценный сорт.

Листья пузыреплодника Ред Барон особенно эффектны: они фактурные, гофрированные, красно-коричневые, на верхушках с оранжевым оттенком. Цветы розовые, плоды красные. Куст компактный, высотой до 2 м, крона густая, полушаровидная.

 

Фото: пузыреплодник Ред Барон

Посадка

Как и все декоративно­лиственные формы садовых растений, пузыреплодники калинолистные с ярко окрашенными листьями нужно сажать на солнечное место, чтобы их листва со временем не позеленела. Хотя это растение может успешно расти и в тени.  К почве у кустарника всего два условия: отсутствие извести и наличие дренажа

Важно также не переувлажнять почву, так как пузыреплодник не переносит застоя влаги.  Лучше всего для посадки приобрести растения с закрытой корневой системой (в контейнерах). Такие кусты можно высаживать в любой период вегетационного сезона

Надо выкопать яму глубиной и диаметром в 50 см, на дно добавить землю, торф, перегной в соотношении 2:1:1. Куст  поместить в приготовленную посадочную яму (главное при этом – не повредить корневой ком и не расправлять его). Яму засыпать плодородной почвой, а само растение заглубить до 5 см. Благодаря этому у пузыреплодника смогут образоваться дополнительные побеги из спящих почек. Обильно полить куст водой и раствором Корневина. Как только вода впитается, нужно замульчировать приствольный круг. 

Описание культуры

Само растение представляет собой выносливый крупный кустарник с каскадными ветвями и темно-зелеными листьями. Некоторые сорта имеют светло-зеленые или даже темные, бордовые цветные листья, делающие этот кустарник эффектным даже тогда, когда он не цветёт. Пузыреплодник начинает цвести и плодоносить с четырёх лет. Цветки чашеобразные, от белого до бледно-розового оттенка, сформированы в соцветия. Яркие красные плоды добавляют растению контрастный цвет осенью. С окрашенным в красноватый цвет корой, этот кустарник выглядит привлекательно на протяжении целого сезона.

Пузыреплодник однопестичный, Торрея (Physocarpus monogynus)

Высота Пузыреплодника варьируется от 1,5м до 3 м, но в основном высота редко превышает 2 м. Крона кустарника, как правило, имеет шаровидную форму с раскидистыми ветвями. Листья напоминают листву клена, имея три или пять лепестков. Пузыреплодник — выносливый кустарник, некоторые виды выдерживают морозы до -25 градусов и ниже

Советы по созданию композиций и высадке

Растение выигрышно смотрится:

• на белом фоне;
• среди желтолистных и зеленолистных кустарников;
• в одиночной композиции – чередование Диабло с сортами Тильден или Наггет.

Создать круглую форму у этого куста практически невозможно, лучше всего выбрать овал или прямоугольник, поскольку ветви устремляются вверх и быстро разрушают форму идеального круга.

Лютеус. Уникальность это сорта заключается в том, что по своей форме он напоминает куст винограда. И все же, спустить Лютеус с виноградом не удастся, поскольку у пузыреплодника нет ягод, а листья мелкие.

Пузыреплодник калинолистный сорта лютеус

Несмотря на это, кустарник красиво смотрится в садах и очень быстро растет. Летние желтые листья с наступлением осени становятся оранжевыми – на недолгое время. Затем они зеленеют и опадают.

Крона имеет очень необычный вид – если посмотреть под листьями, можно увидеть повисшие ленты вместо коры. Сами ветки растут строго вверх, но достигая небольшого размера, сгибаются. Листья, как и многих других пузыреплодников, заостренные.

Летом на ветвях появляются «коробочки», в которых прячутся цветки. Полное созревание происходит только по осени – в сентябре или начале октября, если в регионе тепло.

Зимой Лютеус хорошо сохраняется. Некоторые ветви замерзают, но вреда для растения это не приносит. Гораздо хуже куст переносит влагу, поэтому его не следует сажать в городах с частыми дождями и высокими (от 60-70%) показателями влажности.

Чтобы листья сохраняли желтый оттенок, куст нужно сажать на солнце. Лучше всего использовать его в парковых садовых композициях.

Тайни Вайн. Этот кустарник очень высокий, и отличается от большинства сортов толстой, прочной кроной, на которой растет много веток. Листья у Тайни Вайн бордовые, но если растение было высажено в тени, то этот оттенок может не проявиться вообще, или только на половину, но преобладающим будет зеленый цвет.

Пузыреплодник калинолистный сорта тайни вайн

Если же растение все лето сохраняло яркий оттенок, то при похолодании первые недели листья станут ярко-красными, из-за чего создается особый контраст с желтеющими в парках деревьями. Тайни Вайн полностью устойчив к перепаду температур, жаре и холоду.

Леди ин Ред. В высоту куст редко достигает чуть больше метра, что является его характерным отличием от других сортов. При этом, как и у многих пузыреплодников, у Леди ин Ред свекольные листья и белые цветы, которые осенью превращаются в плоды.

Пузыреплодник калинолистный сорта леди ин ред

Среди всех красных сортов Леди ин Ред можно легко узнать по своеобразной форме листьев – они напоминают тройную пику с резными краями. Кроме того, на одном побеге может сформироваться целый «букет» листьев – они расположены кучно, а не по отдельности.

Ухаживать за кустарником не нужно. Сорт популярен у садовников из-за неприхотливости и хорошей устойчивости к холодам.

Применение

Используют пузыреплодник Диабло для создания декоративных изгородей, контрастных ландшафтных композиций.

В род растений пузыреплодников входит 14 видов. Одним из наиболее распространенных видов является пузыреплодник калинолистный «Диабло», который имеет листья яркого пурпурно-красного цвета.

Описание пузыреплодника калинолистного «Диабло»

Пузыреплодник имеет очень привлекательный вид благодаря своей форме. Из-за того, что растение достигает как в высоту, так и в диаметре около 3 м, его форма образует полусферу.

Большой плюс пузыреплодника состоит в том, что как весной, так и осенью, его яркая окраска остается неизменной.

Пузыреплодник калинолистный «Диабло» – очень популярное растение. Его с удовольствием высаживают как в садах, на дачных участках, так и на городских улицах. Происходит это из-за простоты в уходе за ним, его красивого внешнего вида, а также его стойкости к загазованности городских улиц и другим неблагоприятным условиям.

Особенно красив пузыреплодник в летнее время, когда происходит его цветение.

В среднем растение живет около 50 лет.

Посадка пузыреплодника калинолистного «Диабло» и уход за ним

Существует несколько способов посадки пузыреплодника:

1. Семенами
   . Считается, что это не самый лучший способ для размножения пузыреплодника «Диабло», так как высока вероятность, что молодое растение не унаследует цвет своего предшественника).
2. Черенкованием
   . Посадка пузыреплодника с помощью черенкования осуществляется в начале или середине лета. С черенков удаляют нижние листья, затем их подрезают, обрабатывают специальным веществом для образования корней – «Корневином». После этого черенки готовы для высадки в землю.
3. Делением куста
   . Размножение растения методом деления куста проводится в весеннее время. Сильно разросшийся куст разделяют и рассаживают отдельно.
4. Методом отводки
   . Посадка пузыреплодника методом отводки также проводится весной. Этот способ посадки достаточно эффективен. Молодой побег без отрезания от материнского растения кладется в ямку, прикапывается землей и регулярно поливается. Перед наступлением зимы побег отрезают от материнского растения и укрывают до весны.

Ухаживать за пузыреплодником чрезвычайно просто. Он приживается как в черноземе, так и в не очень плодородном грунте. Растение хорошо переносит зиму, но может подмерзать в особо суровые морозы.

Но при этом есть момент, на который стоит обратить внимание. Это чувствительность растения к переизбытку влаги в почве

Поэтому не следует высаживать пузыреплодник в низинах

Начиная с момента посадки, и во время дальнейшего ухода за растением, следует позаботиться о дренаже, очень важно не допускать застоя воды в почве

Частота полива растения зависит от качества почвы, а также от времени года и климата. В засушливое летнее время полив необходимо проводить чаще чем обычно, около двух раз в неделю.

Полезно делать подкормку пузыреплодника. Как правило, весной проводят подкормку азотосодержащими удобрениями (мочевина, ), а осенью – минеральными (нитроаммофоска).

Стрижка пузыреплодника «Диабло»

Стрижка пузыреплодника бывает двух видов: санитарная и формовочная.

Санитарная обрезка
проводится с целью удаления старых или поврежденных побегов.

Формовочную обрезку
делают для придания растению формы нужного декоративного вида первый раз весной, а дальше – по мере необходимости. Также иногда применяют омолаживающую обрезку.

Посадив пузыреплодник «Диабло», вы сможете очень эффектно украсить территорию с минимальными затратами сил и времени. Отлично смотрятся как растения, высаженные в виде , так и отдельно посаженный пузыреплодник.

Для декоративного оформления участка предназначено множество разнотипных растений. Среди них выделяются отдельные виды, которые обеспечивают садоводов эстетичным внешним видом и простотой в выращивании. К таким экземплярам и относится Пузыреплодник Диаболо.

Размножение

Этот кустарник размножается несколькими способами

У каждого из них есть свои особенности, на которые нужно обратить внимание

Размножение семенами

Плоды пузыреплодника с семенами

Семена пузыреплодника дают хорошую всхожесть, однако при таком способе размножения нет гарантии сохранения всех сортовых особенностей. Велика вероятность, что у кустов, выращенных из семян, листья будут не красного, а зеленого цвета.

По этой причине размножение семенами применяется крайне редко. Чтобы сохранить оригинальный окрас листьев, размножать пузыреплодник следует вегетативным способом.

Черенкование

Размножение черенками

Это самый простой и достаточно популярный метод, который дает быстрые и традиционно хорошие результаты. Для размножения черенкованием используют зеленые побеги, которые нарезают длиной 10-20 см

Важно, чтобы на каждом черенке было по несколько точек роста

Черенкование проводят весной или в начале лета, до цветения кустарника:

1Черенки отделяют, с нижней половины побега листья удаляют, а с верхней – наполовину укорачивают. Можно также поцарапать кожицу у основания черенков: считается, что в этих местах корешки образуются быстрее.

2Основания полученных черенков замачивают в любом из стимуляторов корнеобразования. Этот этап не является обязательным, поскольку пузыреплодник может успешно укореняться и без стимуляции.

3Побеги высаживают в речной песок или субстрат, состоящий из песка с торфом.

4После посадки черенки следует полить и укрыть полиэтиленовой пленкой.

5Последующий уход до начала зимы заключается в проветривании и систематическом увлажнении. Когда начнут появляться новые листья и побеги, что свидетельствует об успешном укоренении, пленку можно будет снять.

6На зиму укорененные черенки следует укрыть, лучше всего еловым лапником. Основания стеблей мульчируют листвой, торфом или землей.

7Весной молодую поросль можно будет высадить на постоянное место.

Деление куста

Молодые кусты растения

Этот способ менее популярен, чем черенкование, поскольку требует физических усилий, а число молодых растений, полученных в результате деления куста, очень ограничено. Один хорошо развитый взрослый куст можно разделить на 4-6 частей.

Следует проводить деление куста ранней весной, до наступления периода активного роста.

Возможно поведение этой процедуры осенью, после того, как кустарник отцветет, а до морозов останется минимум полтора месяца:

1Под деленки готовят посадочные ямы, а стебли обрезают на уровне 60-70 см. Это пойдет пузыреплоднику только на пользу и будет дополнительным стимулом для появления новых побегов.

2Растение аккуратно выкапывают, полностью извлекая из грунта корневую систему.

3Куст делят таким образом, чтобы каждой части досталось хорошее корневище и одна мощная здоровая ветка длиной более 20 см.

4Отделенные части нужно высадить на новое место как можно быстрее, чтобы не допустить пересыхания корней.

5После этого растения поливают и мульчируют почву, чтобы избежать образования корки.

6В первый год отделенные молодые растения нуждаются в укрытии на зиму.

Размножение отводками

Это достаточно распространенный способ размножения. Проводят такую процедуру в апреле, после того как на побегах появятся первые листочки, чтобы за период вегетации отводок успел укорениться.

Порядок размножения отводками таков:

1С побега удаляют практически все листья, кроме тех, которые находятся на самой верхушке.

2В земле под веткой делают канавку глубиной до 10-15 см.

3Не отрезая подготовленный побег с куста, укладывают его в канавку, пришпиливают к земле и засыпают плодородным грунтом

Кончик побега необходимо оставить открытым, не засыпая землей.

4Важно поливать почву в чересчур засушливые периоды, поскольку без увлажнения еще не совсем окрепшие корни могут погибнуть.

5В конце осени молодые укоренившиеся кусты отделяют от взрослого растения. На зиму их следует укрыть еловым лапником.

6Такая закладка отводков дает неплохие результаты, если для них выбрать сильные и здоровые побеги, направленные наружу.

Вейгела: описание, виды и сорта, посадка в открытый грунт и правильный уход за растением (60 Фото & Видео) +Отзывы

Посадка пузыреплодника Диабло

Пузыреплодник калинолистный предпочитает открытые солнечные места, где приобретает характерную пурпурную окраску. На тенистых участках листва становится более зеленой.

Подготовка участка под посадку

Кустарник хорошо развивается на землях любого типа, но максимальная декоративность достигается на суглинках и природные супесях с хорошим дренажем. Близкое залегание грунтовых вод на участке пагубно сказывается на корневой системе, вплоть до гибели растения.

Правила посадки

Пузыреплодник Диабло с закрытой корневой системой сажают в течение всего сезона методом перевалки. Выкапывают яму немного больше объема земляного кома. Желательно уложить на дно дренажный слой, а сверху насыпать немного плодородной земли. Саженец ставят по центру, засыпают грунтом, поливают и мульчируют опилками.

Куст с открытыми корнями высаживают рано весной или поздней осенью. Перед работой корни замачивают в воде на 2-3 часа. Допускается использование раствора для стимуляции роста и приживаемости. Алгоритм посадки:

• готовят посадочную яму около 60 см диаметром и глубиной;
• на дно насыпают слой дренажа;
• выкопанный грунт смешивают с комплексным минеральным удобрением, перепревшим компостом или навозом;
• ставят саженец так, чтобы шейка ушла вниз на несколько сантиметров, затем расправляют корни;
• засыпают удобренной землей, приствольный круг мульчируют подходящим материалом;
• поливают обильно и поэтапно, дожидаясь полного впитывания влаги.

Молодое растение требует воду каждые 2-3 дня в зависимости от высыхания поверхности. Постоянное умеренное увлажнение проводят до момента образования первых молодых побегов.

Вариант покупки саженцев пузыреплодника в контейнере гарантирует почти 100% приживаемость.

Согласно норме на квадратный метр высаживают 4-10 кустов, соблюдая между ними расстояние не менее 80 см.

Посадка и уход за пузыреплодником Диабло

Посадка калинолистного пузыреплодника Диабло и уход за ним не требуют от цветовода особых навыков. Если правильно выбрать место и приложить минимальные усилия, кустарник может прожить до 40 лет, при этом со временем он не потеряет свой привлекательный вид.

Внимание!
Необходимый и достаточный уход за растением включает в себя регулярные поливы, подкормку, обрезку, рыхление.

Подготовка посадочного участка

Пузыреплодник может расти даже в условиях слабой освещенности, но при выращивании на открытом солнечном участке его листва приобретает необычный пурпурный цвет.

Кустарник нетребователен к составу почвы – он одинаково хорошо чувствует себя на субстратах любого типа, если они дренированы и в меру увлажнены. Лучшие почвы для него – плодородные супеси и суглинки. Единственное требование пузыреплодника – отсутствие застоя влаги. При заболоченности участка куст может погибнуть. По этой же причине нельзя высаживать пузыреплодник в местах с поверхностным залеганием грунтовых вод.

Правила посадки

Если саженец пузыреплодника Диабло приобретен в контейнере, то сажать его можно весь сезон. Растение с открытой корневой системой высаживают весной, до начала вегетации или поздней осенью.

Посадка пузыреплодника Диабло очень проста и происходит по следующему алгоритму:

• выкапывают посадочную яму в 2–3 раза превосходящую размеры корневого кома;
• на дно горкой засыпают грунт на основе торфа или перегноя;
• саженец с открытой корневой системой оставляют в воде на 3–5 часов, а затем сажают;
• контейнерные растения помещают в яму вместе с земляным комом, засыпают питательным грунтом;
• как и при посадке других кустарников и деревьев, заглублять корневую шейку не рекомендуется;
• землю вокруг саженца хорошо поливают, в воду можно добавить стимулятор корнеобразования;
• приствольный круг мульчируют.

Полив и подкормка

Пузыреплодник Диабло плохо переносит засуху. Частота поливов зависит от нескольких факторов. При засушливом лете и в случае, если кустарник растет на суглинке, он нуждается в поливах 1 раз в 3–4 дня. Глинистая почва хорошо сохраняет влагу, поэтому поливать ее можно не чаще 1 раза в неделю. Полив проводят утром или вечером, чтобы избежать солнечных ожогов влажных листьев. Только что посаженные кусты нуждаются в особенно тщательном поливе, поскольку он напрямую влияет на их приживаемость.

Весной в качестве удобрения в воду для полива пузыреплодника добавляют навоз, птичий помет или сорняковый настой. Подойдут также аммиачная селитра и мочевина. Осенью посадки подкармливают растворенной в воде древесной золой. Можно использовать и другие минеральные удобрения.

Обрезка пузыреплодника Диабло

Быстрорастущий пузыреплодник Диабло нуждается в санитарной и формирующей обрезке, особенно в том случае, если используется в качестве живой изгороди. Удалять поврежденные ветви можно в течение всего сезона. Формирующая обрезка проводится весной или осенью. Пузыреплодник отлично восстанавливается после стрижки и откликается на нее бурным ростом молодых побегов.

Подготовка к зиме

Этот кустарник чрезвычайно морозоустойчив и способен выдерживать большие перепады температур, поэтому на зиму укрывают только молодые кусты. Для этой цели больше всего подходит еловый лапник. Взрослые растения в укрытии не нуждаются. В суровые зимы кончики побегов или отдельные ветки могут подмерзнуть, однако это не сказывается ни на самочувствии растения, ни на его декоративных качествах. Поврежденные части просто выстригают во время очередной санитарной обрезки.

Внимание!
Под зиму околоствольные круги взрослых и недавно посаженных растений рекомендуется мульчировать.

Пузыреплодник калинолистный Diablo Dor

(Physocarpus opulifolius «Diablo Dor») Раскидистый куст высотой и шириной до 3м, с поникающими ветвями, образующими густую, полушаровидную крону. Листья 3-5 лопастные, фиолетово-красные, в полной тени — зеленые с небольшим пурпурным оттенком. Цветы многочисленные, бледно-розовые, собранные в щитках (до5см), цветение с начала-середины июня (2- 3 недели). Плоды — сборные (вздутые листовки), фиолетово- красные. Предпочитает солнечные места, выносит полутень и тень, теряя только интенсивность окрашивания. К почве не требователен, но предпочитает суглинистые кислые. Не выносит застоя влаги. Хорошо переносит городскую загрязненность. Морозостоек, но могут подмерзать молодые побеги. Абсолютно неприхотливое, очень эффектное и быстрорастущее растение. Уход заключается в периодических поливах, подкормках, рыхлении почвы и в обрезке старых побегов. Лучше всего пузыреплодник размножается вегетативным путем: делением куста, черенками и отводками. Семенами размножать не рекомендуется, поскольку не все сеянцы имеют такой же яркий цвет листвы, как у родительского растения. Чаще всего производят деление разросшегося куста, лучше это делать весной, или зеленое черенкование – наиболее легкий способ для получения качественного посадочного материала. Черенки с куста срезают начиная со второй половины лета. Укоренять их лучше всего в специально подготовленной теплице, разместив ее в тенистом месте сада. Укоренённые черенки на зиму обязательно надо укрывать. На следующий год успешно перезимовавшие растения можно высаживать на постоянное место. Декоративен в течение всего вегетационного периода своей листвой, цветами и плодами. Из-за своих декоративных качеств и, особенно, высокой неприхотливости и стойкости в городских условиях, рекомендован для широкого применения в озеленении города и частных садов. Пузыреплодник Диабло способен в течение 2-3 лет закрыть проблемные места, создать яркий элемент в сложных контрастных композициях. Живые изгороди из него очень красивые, плотные и легкие в уходе. Прекрасно сохраняет свою яркую окраску на солнечных местах. В тенистых – зеленеет, в зависимости от степени освещенности. Появляющиеся на солнце зеленые побеги необходимо вырезать полностью.

Пузыреплодник калинолистный «Диабло» (Physocarpus opulifolius «Diablo»)

Пузыреплодник калинолистный «Диабло» (Physocarpus opulifolius «Diablo»)

Декоративный кустарник прекрасно вписывается в любой пейзаж. Пышное цветение и декоративные листья станут украшением Вашего сада на протяжении всего сезона.

 

Строение кроны: крона раскидистая, густая. Листья 3 — 5 лопастные, длиной 5 — 10 см.; насыщенно-пурпурного цвета, в густой тени — пурпурно-зелёные; осенью — окраска не изменяется. Цветки мелкие, собраны в плотные щитковидные соцветия (диаметром до 5 см. ). Лепестки цветков — белые или слегка розоватые. Период цветения цветёт растение обильно, в июне — начале июля. Диаметр кроны до 2,5 м.

 

Особенности роста: растет до 20 см в год. Высота до 3 м. 

 

Почва: предпочитает свежие, достаточно увлажненные, хорошо дренированные суглинки.  

 

Влага: умеренно влаголюбива, но не выносит застоя воды.

 

Зона морозостойкости: морозоустойчива.

 

Правила посадки и ухода:

 

 Посадка: высаживать пузыреплодник необходимо на солнечных, хорошо освещенных местах. При посадке обратите внимание на то, чтобы не допускалось уплотнения почвы и застоя воды. Глубина посадочной ямы 40-50 см, укладываем на дно посадочной ямы дренаж из керамзита толщиной до 20 см. Важно чтобы корневая шейка была на уровне земли.  Подготовить специальную почвенную смесь: листовая земля, торф, и песок в соотношении 2:1:2. После посадки дерево необходимо обильно полить 10-15 л воды с корнеобразующими средствами (100-150 г нитроаммофоски, корневин 10 г на 10 л).   

 

 Уход:                                                                                                                                  

 

— регулярный полив и вечернее дождевание;                                                  

 

— весной внести органические удобрения;                                                        

 

— осенью внести калийные удобрения;                                                            

 

— на зиму замульчировать приствольный круг кустарника торфом,

 

корой толщиной 5-6 см, после зимы мульчу  перемешать с землей. 

Пузыреплодник калинолистный Диабло Дор Минди

(описание сорта, фото)

Пузыреплодник калинолистный Диабло Дор Минди – умеренно растущий, очень привлекательный компактный сорт до 2 м высотой с округлой густой кроной диаметром до 2 м, с плотным расположением ветвей. Листва эффектного фиолетово-красного окраса с глубокими надрезами. Цветет в первой половине лета белыми миниатюрными цветками, собранными в щитковые соцветия вдоль стеблей.
Декоративность придает красочная, выразительная, меняющая цвет листва: при распускании — медно-оранжевая, летом — фиолетово-красная. Цветение в виде белых щитков придает особый контраст кусту.
Использование. Как представитель пузыреплодника калинолистного, незаменим для живой изгороди. Также используется при посадке в составе группы и по одиночке. Необычный окрас листьев выделяет пузыреплодник на фоне других растений.
Характеристика растения. Хорошо растет на солнце и в полутени порядка 30-ти лет, листья отвечают на свет насыщенным окрасом. Для придания красивой формы проводят формирующую обрезку, которую можно делать в течение всего сезона. Весной необходима санитарная обрезка — удаляются больные и сломанные ветки. Хорошо переносит городские условия.

 

Как купить саженцы пузыреплодника калинолистного Диабло Дор Минди в питомнике «Сибирский сад»

В нашем питомнике купить саженцы пузыреплодника калинолистного Диабло Дор Минди можно на открытых торговых площадках и в магазинах питомника. Адреса, график работы, телефоны торговых точек смотрите в разделе «Контакты» (в верхнем меню).

Питомник «Сибирский сад» осуществляет доставку саженцев по России. Заказать растения вы можете в нашем интернет магазине по адресу: zakaz.sibsad-pitomnik.ru или перейдите по ссылке в верхнем меню. Информацию об условиях оформления заказов, их оплаты и доставки саженцев по России вы найдете также в интернет магазине в соответствующих разделах.

Питомник Сибирский сад реализует саженцы оптом и приглашает к сотрудничеству организации, занимающиеся продажей саженцев, ландшафтным дизайном, а также организаторов совместных покупок. С условиями сотрудничества можно ознакомиться в разделе «Оптовикам» (в верхнем меню).

Новая роль митохондриального проапоптотического белка SMAC/Diablo в синтезе фосфолипидов, связанном с опухолегенезом

Abstract

Митохондриальный проапоптотический белок SMAC/Diablo участвует в апоптозе, отрицательно регулируя IAP и активируя каспазы, тем самым стимулируя апоптоз. Неожиданно мы обнаружили, что SMAC/Diablo сверхэкспрессируется при раке. Этот парадокс был решен здесь путем подавления экспрессии SMAC/Diablo с использованием специфической siRNA (si-hSMAC). В линиях раковых клеток и ксенотрансплантатах подкожного рака легкого у мышей такое замалчивание уменьшало рост клеток и опухоли.Иммуногистохимия и электронная микроскопия резидуальной опухоли, обработанной si-hSMAC, продемонстрировали морфологические изменения, включая клеточную дифференцировку и реорганизацию в железистые/альвеолоподобные структуры и элиминацию ламеллярных тел, органов, продуцирующих сурфактант. Секвенирование нового поколения нецелевых или обработанных si-hSMAC опухолей выявило измененную экспрессию генов, связанных с клеточной мембраной и внеклеточным матриксом, генов, обнаруженных в просвете ЭР и Гольджи, а также в экзосомальных сетях, генов, участвующих в метаболизме липидов, и переносчиков липидов, метаболитов и ионов.Сайленсинг SMAC/Diablo снижал уровни фосфолипидов, включая фосфатидилхолин. Эти данные свидетельствуют о том, что SMAC/Diablo обладает дополнительными неапоптотическими функциями, связанными с регуляцией синтеза липидов, необходимых для роста и развития рака, и что это может объяснить сверхэкспрессию SMAC/Diablo при раке. Новая функция проапоптотического белка SMAC/Diablo в раковых клетках, связанная с синтезом липидов, делает SMAC/Diablo многообещающей терапевтической мишенью.

Ключевые слова: апоптоз, рак, митохондрии, SMAC/Diablo, синтез фосфолипидов /Diablo-α представляет собой проапоптотический белок митохондриального межмембранного пространства (IMS).1, 2 N-конец SMAC/Diablo служит сигналом митохондриального нацеливания (MTS) и расщепляется с образованием зрелого белка массой 26 кДа. 2 После индукции апоптоза SMAC/Diablo высвобождается в цитозоль,2, 3, где он взаимодействует с членами семейства ингибиторов белка апоптоза (IAP) (cIAP1, cIAP2 и XIAP), чтобы нейтрализовать ингибирующее действие IAP на каспазы и, таким образом, инициировать апоптоз. 4, 5 Взаимодействуя с IAP, SMAC/Diablo действует в виде гомодимера, при этом контакт осуществляется через N-концевой мотив (Ala-Val-Pro-Ile).6 Кроме того, было показано, что SMAC/Diablo контролируется несколькими другими белками, такими как белки семейства Bcl-2,7 членами семейства митоген-активируемых протеинкиназ, такими как Erk1/2,8 и c-Jun N-концевой киназа.9

Хотя существует ряд вариантов SMAC/Diablo, генерируемых альтернативным сплайсингом, SMAC/Diablo-α является основным ингибитором IAP.10 Другая изоформа, SMAC/Diablo-β, в которой отсутствуют оба IBM) и MTS могут сенсибилизировать клетки к апоптозу при сверхэкспрессии 11, что позволяет предположить, что SMAC/Diablo может также выполнять функции, которые не зависят от IBM и митохондрий.Действительно, цитозольная форма SMAC/Diablo-ε, в которой также отсутствуют элементы IBM и MTS, повсеместно экспрессируется в нормальных тканях человека и линиях раковых клеток,12 не участвует в апоптозе и, как было показано, связана с онкогенностью. 13

Мыши, лишенные SMAC/Diablo, жизнеспособны, нормально растут и созревают, имеют эмбриональные фибробласты, лимфоциты и гепатоциты без каких-либо гистологических аномалий и демонстрируют реакции дикого типа на все типы апоптотических стимулов.14 Как и ожидалось, сверхэкспрессия SMAC/Diablo Было обнаружено, что опухолевые клетки сенсибилизируются к апоптотической гибели.15 Было обнаружено, что SMAC/Diablo сверхэкспрессируется при некоторых видах рака и подавляется при других. Например, уровни экспрессии мРНК и белка SMAC/Diablo были снижены в клетках гепатоцеллюлярной карциномы по сравнению с нормальной тканью печени,16 тогда как более высокие уровни были зарегистрированы при раке шейки матки,17 карциномах легких, яичников и предстательной железы, карциномах желудка, 18 почечно-клеточная карцинома,19 и различные типы саркомы.20

Наблюдение, что SMAC/Diablo сверхэкспрессируется в раковых клетках, несмотря на его роль в содействии гибели клеток, предполагает, что он может обладать новой неапоптотической функцией, которую еще предстоит изучить. Это несоответствие рассматривается здесь. Мы демонстрируем, что SMAC/Diablo обладает неапоптотическими функциями, связанными с регуляцией путей биосинтеза фосфолипидов (PL), необходимых для развития рака, так что подавление экспрессии SMAC/Diablo уменьшало размер опухоли и изменяло экспрессию многих генов, индуцируя дифференцировку остаточных опухолевые клетки легкого образуют альвеолоподобные структуры и подвергаются реорганизации микроокружения.

Результаты

Экспрессия белка SMAC/Diablo в опухолях

Уровни экспрессии SMAC/Diablo в образцах от 40 до 80 случайно выбранных нормальных контролей или пациентов с различными типами злокачественного рака оценивали с помощью иммуногистохимии (ИГХ) микрочипов тканей. с использованием SMAC/Diablo-специфических антител.Заметное увеличение уровней экспрессии SMAC/Diablo наблюдалось при различных видах рака, включая легкие, В-лимфому, яички, толстую кишку, желудок, молочную железу, предстательную железу и кожу (А). Не наблюдалось значительного увеличения уровней SMAC/Diablo в раковых тканях головного мозга, яичников, матки, мочевого пузыря, шейки матки, матки, пищевода, головы и шеи, слизистой оболочки кишечника, почек, печени или ротовой полости (данные не показаны).

Сверхэкспрессия SMAC/Diablo в различных клеточных линиях и типах опухолей

(A) Репрезентативное IHC-окрашивание SMAC/Diablo в нормальных (n = 5) и раковых (n = 20) образцах тканей из предметных стекол тканевого микрочипа (US Biomax ), содержащие нормальные и раковые срезы легких, В-лимфомы, яичек, толстой кишки, молочной железы, кожи, предстательной железы и желудка.% случаев представляет собой процент образцов пациентов, окрашенных на SMAC/Diablo с интенсивностью, представленной на шкале в верхней части рисунка. (B) Репрезентативное иммуноблот-окрашивание лизатов тканей здоровых (H) и опухолевых (T) тканей антителами против SMAC/Diablo, причем каждая пара образцов (H, T) получена из одного и того же легкого пациента. (C) Репрезентативные иммуноблоты, демонстрирующие экспрессию SMAC/Diablo в РВМС, полученных от пациентов с ХЛЛ или здоровых доноров. В качестве контроля нагрузки уровни актина исследовали с использованием антител против β-актина.(D) Количественный анализ иммуноблотов уровней экспрессии SMAC/Diablo в РВМС пациентов с ХЛЛ по сравнению со здоровыми донорами (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 10) и в опухоли НМРЛ по сравнению со здоровой тканью того же пациента (среднее значение ± SEM, n = 11), представлено как кратное увеличение. (E и F) Уровни экспрессии SMAC/Diablo в различных клеточных линиях, причем уровни в раковых клетках представлены относительно уровней в нераковых клетках (нижняя часть блота). **р < 0,01; ***р<0,001.

Уровни экспрессии SMAC/Diablo были выше в образцах рака легкого (немелкоклеточный рак легкого [НМРЛ]) по сравнению с соседними здоровыми тканями того же легкого (B).Количественный анализ показал в 3,5 раза более высокие уровни экспрессии SMAC/Diablo в образцах пациентов с НМРЛ по сравнению с соответствующей здоровой тканью (D). Иммуноблоттинг-анализ показал примерно 5-кратное увеличение экспрессии SMAC/Diablo в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) по сравнению с РВМС здоровых доноров (С и 1D).

Уровни экспрессии SMAC/Diablo в раковых клеточных линиях, включая клетки HeLa, A549, h458, HepG2, MCF7, MDA-MB-231, U-87MG, U-118MG, THP1 и KG-la, составляли около 2- до 4 раз выше, чем в нераковых клеточных линиях TREx-293, HEK293, HaCaT и WI-38, а также в первичных клетках мозга мыши (PBCs) (E и 1F).

Сайленсинг SMAC/Diablo ингибирует рост клеток

Чтобы изучить возможные функции SMAC/Diablo при раке, его экспрессию в ряде линий раковых клеток человеческого происхождения различного происхождения (например, HeLa, A549, h458, MCF-7, клетки PC3, HepG2, MDA-MB-231, PANC-1 и HTB-72) подавляли с помощью миРНК, специфичной к SMAC/Diablo человека (si-hSMAC-A). Уровни экспрессии SMAC/Diablo были заметно снижены (80–90 %) во всех протестированных клеточных линиях (A и S1A), при этом максимальное снижение на 90 % наблюдалось через 48 часов.Через 96 часов после трансфекции этот уровень снизился до 65% (B, 2C, S1B и S1C).

Сайленсинг с помощью si-hSMAC-A ингибирует рост клеток

(A) Указанные линии раковых клеток трансфицировали с помощью si-hSMAC-A (50 нМ), и через 48 часов после трансфекции определяли уровни SMAC/Diablo в клетках оценивали иммуноблоттингом. β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. (B) Клетки A549 и h458 трансфицировали si-NT или si-hSMAC-A, и в указанное время клетки собирали и анализировали на уровни SMAC/Diablo с помощью иммуноблоттинга. β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. На (C) был проведен количественный анализ иммуноблота (представленный в виде % снижения экспрессии) для всех клеточных линий через 24 часа (черная полоса), 48 (светло-серая полоса), 72 (темно-серая полоса) и 96 часов ( белая полоса) после трансфекции (означает ± стандартная ошибка среднего, n = 3). (D) Клетки A549 и h458 не обрабатывали (закрашенный кружок) или трансфицировали si-NT (незаштрихованный кружок) или si-hSMAC-A (50 нМ) (закрашенный треугольник), и рост клеток анализировали в указанные моменты времени с использованием SRB. метод (среднее ± SEM, n = 3).(E) Клетки A549 трансфицировали si-NT или si-hSMAC B, C или D (50 нМ), и в указанные моменты времени клетки собирали и анализировали на уровни SMAC/Diablo с помощью иммуноблоттинга. β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. (F) Гистограмма представляет ингибирование роста клеток A549, обработанных si-NT или si-hSMAC B, C или D (50 нМ) (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 3). (G и H) Линии клеток A549, h458, HaCaT и WI-38 трансфицировали указанными концентрациями (10–50 нМ) si-NT или si-hSMAC-A. Через 48 часов уровни SMAC/Diablo в клетках анализировали с помощью иммуноблоттинга (G) и анализировали рост клеток (H) (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 3).(I) клетки A549, обработанные si-NT или si-hSMAC-A (50 нМ), анализировали на экспрессию Ki-67 с использованием специфических антител, а ядра окрашивали DAPI. (J) Количественный анализ Ki-67-положительных клеток (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 3). (K) Количественный анализ интенсивности окрашивания Ki-67, выполненный с использованием программного обеспечения ImageJ (среднее ± SEM, n = 3). ***р<0,001.

Влияние сайленсинга SMAC/Diablo на рост клеток исследовали с помощью анализа сульфородамина B (SRB). В трех протестированных клеточных линиях (HeLa, A549 и h458) через 120 часов после трансфекции si-hSMAC-A, наиболее активной siRNA, наблюдалось снижение пролиферации клеток на 70–80%, тогда как контрольные клетки, трансфицированные не -нацеленная миРНК (si-NT) не оказала значительного влияния на рост клеток (D и S1D).

Было также обнаружено, что три другие siРНК, предназначенные для нацеливания на hSMAC (от B до D), ингибируют экспрессию SMAC/Diablo и рост клеток в различной степени (E и 2F). В иммортализованных нераковых клеточных линиях, включая клетки WI38 и HaCat, si-hSMAC-A снижал экспрессию SMAC/Diablo (G), но не влиял на рост клеток (H). Клетки рака легкого, обработанные si-hSMAC-A, показали снижение (35%) количества клеток, экспрессирующих фактор клеточной пролиферации Ki-67 (I и 2J; таблица S1). Анализ интенсивности окрашивания Ki-67 (K) показал снижение интенсивности примерно на 85%.Поскольку уровни Ki-67 увеличиваются по ходу клеточного цикла, это снижение экспрессии предполагает, что клетки, обработанные si-hSMAC-A, не продвигаются по клеточному циклу. Анализ клеточного цикла выявил примерно 3-кратное увеличение числа клеток в S-фазе в клетках A549, обработанных si-hSMAC, по сравнению с клетками, обработанными si-NT (рисунок S1H; таблица S1), что позволяет предположить, что SMAC/Diablo-истощенный клетки имеют сниженную способность переходить в S-фазу. Следовательно, включение BrdU уменьшилось на 35% (рисунок S1I; таблица S1).Сообщалось о положительной линейной корреляции между скоростью включения BrdU и долей клеток в S-фазе, при этом остановка S-фазы приводила к снижению включения BrdU21. на 20–35 % (рис. S1J), что может частично способствовать замедлению наблюдаемого роста клеток. Напротив, подавление активности SMAC/Diablo не влияло на общую выработку реактивных окислительных частиц (АФК) ни в клетках, как анализировали с помощью флуоресценции 2′,7′-дихлорфлуоресцеина (DCF), ни в митохондриях, как измеряли с помощью MitoSOX Red. , индикатор митохондриального супероксида (рис. S2).

Не наблюдалось значительной клеточной гибели (5–10 %) клеток HeLa, A549 или h458, подавленных для экспрессии SMAC/Diablo (рис. S3A–S3C), что позволяет предположить, что снижение роста клеток было связано с ингибированием клеточной пролиферации а не усиление гибели клеток. Как и ожидалось, селенит индуцировал гибель клеток. Более того, апоптоз индуцировался сверхэкспрессией SMAC/Diablo или SMAC/Diablo-GFP в клетках HeLa, A549 и h458 в зависимости от концентрации и времени, как и ожидалось (рис. S3D-S3F).

Замалчивание экспрессии SMAC/Diablo ингибирует рост опухоли у мышей

Действие si-hSMAC-A тестировали на подкожном (п/к) опухолевом ксенотрансплантате клеток A549, пересаженных на бестимусных мышах (). После образования опухоли (75–90 мм ³ ) мышей разделили на три сопоставимые группы и каждые 3 дня вводили либо si-NT (группа 1), либо si-hSMAC-A в дозе 350 нМ (группа 2) или 700 нМ. нМ (группа 3). За ростом опухоли следили в течение 39 дней (А). Объем опухоли (ОО), обработанной si-NT, увеличился в 13 раз, тогда как обработка 700 нМ si-hSMAC-A заметно снизила рост (A).Сравнение размеров опухолей в конечной точке выявило уменьшение на 35% и 85% объема опухолей, обработанных si-hSMAC-A при уровнях 350 нМ и 700 нМ соответственно.

si-hSMAC ингибирует рост опухоли ксенотрансплантатов рака легкого

(A) Клетки A549 инокулировали голым мышам (3 × 10 ⁶ клеток/мышь). Объемы опухоли контролировали, и на 18-й день мышей с аналогичными средними объемами (75–90 мм ³ ) разделили на три группы (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 5). В ксенотрансплантаты вводили si-NT (закрашенный кружок; 350 нМ) или si-hSMAC-A (350 нМ [незаштрихованный кружок] или 700 нМ [закрашенный треугольник]).Были измерены размеры ксенотрансплантатов и рассчитаны средние объемы опухолей, которые представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, **p ≤ 0,01; ***р ≤ 0,001. Репрезентативные фотографии (B) и веса (C) рассеченных опухолей из ксенотрансплантатов клеток мыши A549 после обработки si-NT или si-hSMAC-A (среднее ± стандартная ошибка среднего, n = 5). (D) Репрезентативные срезы si-NT- и si-hSMAC-A-TT, окрашенные антителами против SMAC/Diablo. (E) Экспрессию изоформ α- и ε- SMAC/Diablo в РНК, выделенной из si-NT- и si-hSMAC-A-TT, определяли с использованием количественной ПЦР и специфических праймеров.(F) Репрезентативные срезы si-NT- и si-hSMAC-A-TT, окрашенные антителами против Ki-67. (G) Количественный анализ Ki-67-позитивных клеток на уровне IHC (серые столбцы) и мРНК (черные столбцы) в si-NT- и si-hSMAC-A-TT (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 3). ***р ≤ 0,001.

Всех мышей умерщвляли через 39 дней после инокуляции клеток, опухоли вырезали (B) и взвешивали (C). Это выявило уменьшение массы опухоли на 40% и 75% для 350 и 700 нМ si-hSMAC-A-TT, соответственно, значения, аналогичные рассчитанным объемам опухоли (A).Половину каждой опухоли вырезали и фиксировали, а парафиновые срезы анализировали с помощью ИГХ. si-NT-TT были сильно иммуноокрашены антителами против SMAC/Diablo. Как и ожидалось, окрашивание SMAC/Diablo было очень слабым в si-hSMAC-A-TT (D). Аналогичные результаты были получены с использованием количественной ПЦР (рис. S5B). В опухолях, происходящих от A549 (E), не было обнаружено экспрессии варианта альтернативного сплайсинга SMAC/Diablo -ε, хотя эта изоформа ранее была обнаружена в тканях здорового человека и в нескольких линиях раковых клеток.12

Уровни экспрессии фактора клеточной пролиферации Ki-67, согласно анализу окрашивания IHC или количественной ПЦР, были заметно снижены (∼80%) в si-hSMAC-A-TT (F и 3G; таблица S1). Аналогичные результаты были также получены с клетками рака молочной железы MDA-MB-231 (рис. S4).

Замалчивание SMAC/Diablo изменяет экспрессию белков, связанных с апоптозом

Окрашивание TUNEL выявило отсутствие апоптоза либо в si-NT-TT, либо в si-hSMAC-A-TT (рис. S5). Поскольку SMAC/Diablo, высвобождаемый из митохондрий во время апоптоза, связывается и противодействует активности IAP, что приводит к высвобождению связанных каспаз1, мы проанализировали уровни экспрессии генов XIAP1, cIAP1 и cIAP2, а также уровни проапоптотических белков. , такие как каспазы 3, 8 и 9, Cyto c и AIF.Уровни экспрессии этих генов были заметно снижены, как показали количественная ПЦР (рис. S5B и S5C) и IHC (для XIAP; рис. S5D).

Как было обнаружено в клеточной культуре, иммуноблоттинг (рис. S6A и S6B) и количественная ПЦР (рис. S6C) клеток HeLa, A549 и h458, обработанных si-hSMAC-A, выявили снижение уровней экспрессии не только SMAC/Diablo но и его связывающего белка XIAP. Сайленсинг SMAC/Diablo также влиял на уровни экспрессии белков, связанных с апоптозом, включая каспазы 3, 8 и 9, хотя и временным образом, при этом наблюдалось повышение экспрессии с последующим снижением через 96 часов после трансфекции.

Таким образом, эти результаты указывают на перекрестную связь между уровнями экспрессии SMAC/Diablo и различными белками, связанными с апоптозом.

Замалчивание экспрессии SMAC/Diablo изменяет морфологию остаточной опухоли

Окрашивание H&E срезов si-NT-TT и si-hSMAC-A-TT продемонстрировало в основном схожую морфологию ткани рака легкого, включая кистоподобные структуры (A). Однако дальнейший морфологический анализ показал, что в si-hSMAC-A-TT клетки были организованы в виде железистых альвеолярных кластеров, окруженных цепочкой клеток (B, вставка), которые не были видны в si-NT-TT (B ).Эти особенности можно интерпретировать как показательные для клеток A549, подвергшихся процессу дифференцировки.

Морфологические изменения, индуцированные в опухолях, обработанных si-hSMAC

(A) Репрезентативные срезы si-NT- и si-hSMAC-A-TT, окрашенные H&E. (B) Увеличенные изображения репрезентативных срезов si-NT- и si-hSMAC-A-TT, окрашенных H&E, показывающие железистые кластеры, окруженные цепочкой клеток (черные стрелки) в si-hSMAC-A-TT. (C-E) Срезы si-NT- и si-hSMAC-A-TT, окрашенные антителами против просурфактанта C (C) или антителами против подопланина (D).(E) Увеличенное изображение репрезентативного среза si-hSMAC-A-TT, окрашенных антителами против подопланина, показывающее клетки с удлиненными ядрами, AT1-подобные клетки (черные стрелки) и неокрашенные клетки, с AT2-подобными клетками, представляющими большие круглые ядра (красные стрелки). (F) Микрофотография опухоли, обработанной si-hSMAC-A, окрашенной толуидиновым синим. Стрелки указывают на железистоподобные скопления, окруженные цепочкой клеток. (G) Репрезентативные срезы si-NT- и si-hSMAC-A-TT, окрашенные антителами против CD31.Синие стрелки указывают на альвеолярные капилляры. Черные и красные стрелки указывают на AT1-подобные и AT2-подобные клетки соответственно. (H и I) Схематическое изображение поперечного сечения альвеол с указанием основных типов клеток.

В легких клетки легочного альвеолярного типа I (AT1) представляют собой длинные и тонкие уплощенные плоскоклеточные клетки, которые составляют примерно 95% альвеолярной поверхности и прилегают к капиллярным эндотелиальным клеткам, образуя область газообмена в легких. Альвеолярные эпителиальные клетки типа II (AT2) кубовидной формы, продуцирующие сурфактант, покрывают оставшиеся 5% альвеолярной поверхности.22, 23 Клетки AT2 могут трансдифференцироваться в клетки AT1, чтобы восстанавливать повреждения 24 и поддерживать нормальную архитектуру легких. 25, 26, 27 Чтобы исследовать эту способность, мы проанализировали экспрессию ассоциированного с легкими сурфактантного белка C (SP-C). (C), компонент поверхностно-активного липопротеинового комплекса, который необходим для правильного биофизического функционирования легких и экспрессируется в клетках AT224, 25, 26 в клетках A549, считающихся клетками AT2-типа.28 Нет существенных различий в Было обнаружено окрашивание SP-C в si-NT-TT и si-SMAC-A-TT (C).

Также оценивали экспрессию клеточного маркера подопланина AT1 (также известного как T1α или PDPN), мембранного сиалогликопротеина муцинового типа,24. Окрашивание подопланином наблюдалось только в si-hSMAC-A-TT, при этом окрашенные клетки окружали область клеток, напоминающую клетки AT2 (D и 4E). Клетки, окрашенные подопланином, включали клетки с удлиненным ядром (Е), которые могут представлять собой клетки АТ1. Это также было показано в si-hSMAC-A-TT, окрашенных толуидиновым синим, показывая железистые кластеры, окруженные цепочкой клеток (F).Это согласуется с предположением, что клетки остаточной опухоли подверглись дифференцировке в AT1-подобные клетки. Дальнейший структурный анализ показал, что клетки, которые создали цепочку вокруг железоподобных структур, были положительно окрашены на маркер эндотелиальных клеток CD31 (G и S7A-S7C) и были организованы подобно альвеолам легких. Напротив, в si-NT-TT CD31-позитивные клетки были уплощены и беспорядочно распределены по всей площади опухолевой ткани (G и S7A).

Результаты гистологического анализа могут отражать сценарий, согласно которому si-NT-TT CD31-позитивные клетки участвуют в процессе опухолевого ангиогенеза, в то время как в si-hSMAC-TT клеточная организация больше напоминает нормальную физиологическую альвеолярную эндотелиальную устройство предназначено для обмена O ₂ . Схематическое представление поперечного сечения альвеол предлагается для сравнения с железоподобными структурами, наблюдаемыми в si-hSMAC-A-TT (H и 4I).

Дальнейшее подтверждение этой точки зрения исходит из анализа формирования стромы в окрашенных H&E si-NT-TT и si-hSMAC-A-TT (). В то время как стромальные структуры в si-NT-TT были тонкими, казались хрупкими и были рассеяны по всей ткани, в si-hSMAC-A-TT можно было увидеть массивные фиброзные структуры, напоминающие рубцовую ткань (A). Кроме того, стромальные структуры в si-NT-TT были обогащены сосудистыми образованиями, связанными с ангиогенезом, которые были едва заметны в si-hSMAC-A-TT (B).

Окрашивание стромальных маркеров в si-NT-TT и si-hSMAC-A-TT

Репрезентативные срезы si-NT-TT и si-hSMAC-A-TT, окрашенные H&E, показывающие стромальные структуры (A) и сосудистые образования с эритроцитами (синие стрелки) в si-NT-TT, но не в si-hSMAC-TT (B). Репрезентативные срезы si-NT-TT и si-hSMAC-A-TT, окрашенные сириус-красным (C), виментином (D) и антителами против α-гладкомышечного актина (SMA) (E).

Окрашивание коллагена и промежуточных филаментов сириус-красным и виментином, соответственно, связано с активностью стромы опухоли.29 Сходное окрашивание Sirius red и виментином в si-NT- и si-hSMAC-A-TT (C и 5D) указывает на отсутствие существенных различий в присутствии мезенхимальных клеток и продукции коллагена в si-NT- и si-SMAC. -А-ТЦ. Напротив, окрашивание на α-SMA, маркер миофибробластов и ассоциированных с раком фибробластов (CAF), наблюдалось в основном в si-NT-TT и было значительно снижено в si-hSMAC-A-TT (E), что свидетельствует о снижении инфильтрации миофибробластов. и/или CAF. Эти результаты демонстрируют различия в активности мезенхимальных клеток, связанной с онкогенностью и формированием рубцовой стромы (связанной с нормальным заживлением ран) между si-NT- и si-hSMAC-TT.

Сверхэкспрессия SMAC/Diablo обнаружена в ядре и цитозоле

Интересно, что мы отметили, что, хотя SMAC/Diablo известен как митохондриальный белок, его высокие уровни также были обнаружены в ядре и цитозоле образцов микрочипов ткани НМРЛ (A). Анализ IHC показал, что SMAC/Diablo был обнаружен в ядре примерно в 50% образцов (B). Ядерная локализация SMAC/Diablo также была обнаружена в si-NT-TT с помощью IHC (C) и иммунофлуоресцентного окрашивания (D). Однако при анализе различных видов рака (+) выявлена ​​ядерная локализация SMAC/Diablo, помимо НМРЛ, только при диффузной В-лимфоме (Д).SMAC/Diablo, локализованные в цитозоле, также были обнаружены в опухолях NSCLC со сверхэкспрессией SMAC/Diablo (рис. S7D и S7E).

Ядерная и митохондриальная локализация SMAC/Diablo

(A) IHC-окрашивание экспрессии SMAC/Diablo в нормальных и раковых тканях легкого из предметных стекол тканевых микрочипов (US Biomax). Процент указывает долю образцов (n = 70), окрашенных с указанной интенсивностью. (B) Репрезентативные изображения IHC, показывающие ядерную локализацию SMAC/Diablo в ткани рака легкого.(C) Репрезентативные срезы si-NT-TT и si-hSMAC-A-TT, полученные из клеток A549, окрашенных антителами против SMAC/Diablo. Синие стрелки указывают на положительное иммуноокрашивание SMAC/Diablo в ядрах. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание SMAC/Diablo и DAPI репрезентативных срезов si-NT-TT и si-hSMAC-A-TT. (E) Репрезентативное IHC-окрашивание B-лимфомы из предметных стекол тканевых микрочипов, окрашенных антителами против SMAC/Diablo. Желтые стрелки указывают на положительное иммуноокрашивание белка в ядрах.(F) Репрезентативное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов si-NT-TT и si-hSMAC-A-TT, показывающее совместную локализацию SMAC/Diablo (красный) и цитохрома c (зеленый) в митохондриях и SMAC/Diablo, с окрашиванием ядер DAPI (синим). Белые стрелки на увеличенном изображении указывают на SMAC в ядре.

Субклеточную локализацию SMAC/Diablo в si-NT-TT дополнительно анализировали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием анти-Cyto антител c в качестве митохондриальных маркеров и конфокальной микроскопии (F).Результаты показывают высокую совместную локализацию окрашивания SMAC/Diablo и Cyto c в si-NT-TT, что отражено в объединенных изображениях. Здесь также в ядре был обнаружен SMAC/Diablo. Как и ожидалось, в si-hSMAC-A-TT не было обнаружено SMAC/Diablo.

NGS и функциональный анализ si-NT- и si-hSMAC-TT

Секвенирование следующего поколения (NGS) использовали для исследования изменений в паттернах экспрессии генов в si-NT- и si-hSMAC-A-TT ( ; Таблицы S4–S6). Такой анализ выявил 848 генов, половина из которых человеческие (428; 50.5%), и половина из них мышиные (420; 49,5%), которые показали значительные изменения (≥1,5-кратное изменение, скорректированное значение p <0,05). Поскольку si-hSMAC-A специфичен для человека, любой эффект на экспрессию генов мыши должен быть опосредован опухолевыми клетками человека. Здесь мы проанализировали только измененную экспрессию генов человека в опухоли. Влияние подавления человеческого SMAC/Diablo на микроокружение клеток мыши-хозяина в опухоли выходит за рамки настоящего исследования.

Дифференциально экспрессируемые гены и субклеточные морфологические изменения, вызванные снижением уровней SMAC/Diablo и белки в эндоплазматическом ретикулуме и просвете Гольджи, связанные с образованием везикул.Количество генов и значения p указаны для каждой категории. (C) Изменения (выявленные NGS) в экспрессии генов, связанных с транспортом, синтезом и деградацией липидов в si-hSMAC-A-TT, представленные как кратное изменение, по сравнению с их экспрессией в si-NT-TT (означает ± SEM, n = 3). (D) Репрезентативные электронно-микроскопические изображения срезов ксенотрансплантата A549, обработанных si-NT и si-hSMAC-A. Стрелки указывают на пластинчатые тела. (E) Уровни PC и фосфолипидов (PL) в si-hSMAC-A-TT по сравнению с si-NT-TT (среднее ± SEM, n = 3), определенные, как описано в дополнительных материалах и методах. (F) Изменения экспрессии мРНК (кПЦР) ферментов, связанных с синтезом фосфатидилхолина, в si-hSMAC-A-TT по сравнению с si-NT, представленные как кратное изменение (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 3). (G) Схематическое изображение путей синтеза диацилглицеролов (а) и фосфатидилхолина (b и c) с генами, активируемыми вниз и вверх, обозначенными стрелками.

Из человеческих генов, экспрессия которых была изменена после подавления активности SMAC/Diablo, 186 были активизированы, а 242 — подавлены. Функциональный анализ (система Gene Ontology, DAVID) экспрессии генов в si-NT- и si-hSMAC-A-TT выявил дифференциальную экспрессию генов, связанных с ключевыми функциями и путями, связанными с онкогенностью (; таблицы S4–S6).Основные функциональные группы, в которых были замечены изменения, представлены ниже.

Гены, связанные с мембранами, органеллами и внеклеточным матриксом

Экспрессия около 200 генов, связанных с клеточной мембраной, экзосомами и внеклеточным матриксом, а также белки, обнаруженные в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и просвете Гольджи, были изменены. В то время как гены, связанные с клеточной мембраной, внеклеточными экзосомами и внеклеточным матриксом, регулируются как вверх, так и вниз, гены, связанные с ER и просветом Гольджи, регулируются только вниз (A и 7B; Table S4).Некоторые из этих результатов были подтверждены с помощью количественной ПЦР (рис. S8).

Гены, связанные с транспортом, синтезом и регуляцией липидов

Изменения в мембранной системе могут отражать нарушение компонентов мембраны, таких как те, которые участвуют в синтезе PL, при восстановлении SMAC/Diablo. Действительно, si-hSMAC-A-TT показали изменения в уровнях экспрессии генов, связанных с транспортом, синтезом и регуляцией липидов (C; таблица S5). К ним относятся удлинение белка 4 длинноцепочечных жирных кислот (ELOV4; 145-кратное), ELOV3 (7-кратное) и ATP10B (25-кратное), что опосредует транспорт PL от внешнего к внутреннему листку различных мембран. , StARD10, участвующий в переносе фосфатидилхолина (PC) и фосфатидилэтаноламина (PE) между мембранами, липаза LIPH, катализирующая выработку 2-ациллизофосфатидной кислоты, и фосфолипаза C, расщепляющая PL, все из которых были активированы. В то же время глицеролкиназа (ГК), диацилглицерол (ДАГ) киназа дельта (ДГКД), фосфорилирующая ДАГ с образованием фосфатидной кислоты, и ацил-КоА-дегидрогеназа (АКАД10), участвующие в бета-окислении жирных кислот в митохондриях , были снижены в si-SMAC-TT (C; Таблица S5). Кроме того, экспрессия SLC44A4, который опосредует транспорт холина, была увеличена в si-hSMAC-A-TT (рис. S8A).

Гены, связанные с переносчиками метаболитов и ионов и с клеточным метаболизмом

Другая интересная группа дифференциально экспрессируемых генов включает гены, связанные с транспортом метаболитов и ионов (рис. S8A и S8B; таблица S5).В si-hSMAC-A-TT гены со сниженной экспрессией включали несколько членов семейства переносчиков растворенных веществ (SLC), которые опосредуют котранспорт натрия/бикарбоната и натрия/калия/кальция, переносчика органических анионов, который транспортирует простагландины PGD2, PGE1. , PGE2 и митохондриальный переносчик железа. Другие гены, экспрессия которых снижена в si-hSMAC-A-TT, связаны с созреванием легких, включая ко-транспортеры бикарбоната натрия (SLC4A4, NBC) и натрий- и хлорид-зависимый переносчик глицина 1 (SLC6A9).

Активированные гены включали симпортер H ⁺ / сахарозы, гены, участвующие в регуляции метаболизма липидов, переносчик тиаминпирофосфата (TPP), катионный / протонный антипортер, а также гены, кодирующие несколько каналов для K ⁺ , Na ⁺ и Cl ^— (рисунок S8A; таблица S5). Повышенные уровни аноктамина-1 (ANO1), чувствительного к напряжению кальций-активируемого хлоридного канала, который регулирует трансэпителиальный транспорт анионов, который необходим для физиологии дыхательных путей легких,30 Са ²⁺ -активируемого калиевого канала KCNN4 и были отмечены двухпоровые калиевые (K2P) каналы KSNK1, которые участвуют в гидратации поверхности дыхательных путей [31].То же верно и для эпителиального канала Na ⁺ (α-ENaC/SCNN1A), критического фактора перинатального периода развития легких, участвующего в клиренсе легочной жидкости.32

Метаболические гены, экспрессия которых изменена в sh-hSMAC-A-TT включали дегидрогеназы и деаминазы, ответственные за опосредование превращения оксалоацетата в фосфоенолпируват, алкогольдегидрогеназу, гексозо-6-фосфатдегидрогеназу и аденозиндезаминазу, все из которых были подавлены (рисунок S8B; таблица S5). Активированные гены, кодирующие ферменты, участвующие в синтезе нуклеотидов (цитидиндезаминаза, эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролаза, активируемая кальцием нуклеотидаза 1), метаболизме аминокислот (пептидиларгининдезиминаза, глутаминпируваттрансаминаза), биосинтезе олигосахаридов и гликозилировании белков (гликозилтрансферазы, фукозилтрансферазы, бета- галактозид альфа-2,3-сиалилтрансфераза, полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансфераза) (рисунок S8B; таблица S5). Уже сообщалось, что большинство транспортеров и связанных с метаболизмом белков с модифицированной экспрессией в si-hSMAC-A-TT связаны с несколькими видами рака, помимо проанализированного здесь рака легких (таблица S5).

Гены, связанные с воспалением и микроокружением опухоли

si-hSMAC-A-TT также показали снижение экспрессии генов, связанных с воспалением и микроокружением опухоли, включая цитокины, хемокины, родственные им рецепторы и внутриклеточные белки, связанные с воспалительными и иммунными реакциями (таблица S6). Выбранные результаты были подтверждены количественной ПЦР (рис. S8C). К ним относятся цитокин интерлейкин (IL)-6, который, как известно, участвует в канцерогенности и активации факторов транскрипции, таких как STAT3, связанных с онкогенностью.33 Кроме того, результаты анализа NGS и qPCR показали снижение уровней синтазы оксида азота 1 (NOS1), важного фактора онкогенности и ангиогенеза, и митохондриальной супероксиддисмутазы 2 (SOD2) (таблица S5; рисунок S8C). .34 Наблюдалось аналогичное окрашивание si-NT- и si-hSMAC-A-TT макрофаг-специфическим антителом F4/80 (рис. S8D).

Из этих результатов можно сделать вывод, что активация экспрессии SMAC/Diablo в опухолевых клетках может быть связана с усилением воспалительной активности, которая необходима для канцерогенности, инвазивности, метастазирования и ангиогенеза.

Ультраструктура и синтез липидов в si-NT- и si-hSMAC-TT

Поскольку замалчивание SMAC/Diablo приводило к морфологическим изменениям (), мы проанализировали субклеточную ультраструктуру si-NT- и si-hSMAC-TT с использованием трансмиссионных электронов. микроскопия (ПЭМ) (D и S9A). В si-NT-TT наблюдалось большое количество внутриклеточных везикул разного размера и плотности, таких как крупные везикулы, содержащие пластинчатые тела, накапливающие сурфактант, и другие. Такие везикулы не наблюдались в si-hSMAC-TT (D и S9A).

Кроме того, основная форма ДНК в ядре клеток в si-NT-TT представляла собой темноокрашенный гетерохроматин, в то время как в si-SMAC-TT ДНК в основном обнаруживалась в виде эухроматина и плохо окрашивалась (D). Интересно, что эухроматин преобладает в клетках, которые активны в транскрипции многих генов, тогда как гетерохроматин наиболее распространен в менее активных клетках. Это может быть связано с процессами дифференцировки клеток. Более того, размеры ядер в si-hSMAC-A-TT были почти в два раза больше, чем в si-NT-TT (D, S9A и S9B; таблица S1).Большие ядра в si-NT-TT могут быть результатом изменений текучести мембраны и/или осмоляльности, что отражено в измененной экспрессии транспортеров (рисунок S8A; таблица S5).

Наконец, мы проанализировали количество общих PL и, в частности, PC в липидных экстрактах si-NT- и si-hSMAC-A-TT (E). Общие уровни PL и PC были снижены на 47% и 37% соответственно в si-hSMAC-A-TT. Эти результаты согласуются с выводами о том, что сайленсинг SMAC/Diablo приводит к изменениям уровней экспрессии генов, связанных с транспортом, синтезом и регуляцией липидов (C; Table S5).Поэтому с помощью qPCR мы проанализировали уровни генов, кодирующих ферменты, связанные с синтезом DAG, такие как GK, и митохондриальные белки глицерол-3-фосфатацилтрансферазы 1 и 4 (GPAM1, GPAM4). Было обнаружено, что все они были снижены в si-SMAC-TT (F). Кроме того, уровни мРНК, кодирующие ферменты, участвующие в синтезе ФХ, также были снижены (F), в то время как уровни мРНК, кодирующие другие ферменты, связанные с синтезом ФХ из ФЭ, а именно ФЭ-N-метилтрансферазу (PEMT), холин/этаноламинкиназу A (CHKA) и холинфосфотрансфераза 1 (CHPT1) и фосфолипаза A2 (PLA2G1B) были повышены.Эти результаты представлены в путях синтеза ПК и ДАГ, изображенных в G.

Обсуждение

Парадокс сверхэкспрессии проапоптотического белка SMAC/Diablo при раке

Мы () и др.16, 17, 18, 19, 20 , 35 продемонстрировали сверхэкспрессию SMAC/Diablo при многих типах рака. Это неожиданно, учитывая проапоптотическую активность белка, который способствует активации каспазы путем связывания IAP.1, 2 Мы показали, что подавление экспрессии SMAC/Diablo в различных клеточных линиях ингибирует их рост, в то время как в ксенотрансплантатах рака легкого, таких как экспрессия ингибировала рост опухоли и приводила к образованию железистых/альвеолоподобных морфологических структур, указывающих на дифференцировку раковых клеток.Эти результаты показывают новую не связанную с апоптозом функцию SMAC/Diablo при раке, связанную с синтезом липидов. Эта функция важна для роста раковых клеток и развития опухоли и, таким образом, может стать новой мишенью для терапии рака.

Поскольку SMAC/Diablo является промотором гибели клеток, мы задались вопросом, как раковые клетки переносят повышенную экспрессию SMAC/Diablo и какие преимущества дает сверхэкспрессия SMAC/Diablo раковым клеткам. Хотя точные ответы на эти вопросы неясны, поскольку SMAC/Diablo расположен в митохондриях (F), его активность, вызывающая смерть, предотвращается.Наши данные показывают, что SMAC/Diablo необходим для роста раковых, но не нераковых клеток в культуре и для роста опухоли. Более того, наши результаты прямо указывают на то, что SMAC/Diablo является важным регулятором транспорта и синтеза липидов, как обсуждается ниже.

SMAC/Diablo-сайленсинг приводил к снижению Ki-67, клеточного маркера пролиферации,36 как в культуре (I и 2J; таблица S1), так и в опухолях (F и 3G; таблица S1). Белок Ki-67 обнаруживается во всех фазах клеточного цикла, кроме фазы покоя G ₀ .Во время S-фазы уровни белка Ki-67 заметно повышались, причем эти уровни сохранялись в интерфазе и М-фазе.37 Кроме того, клетки, обработанные si-hSMAC, задерживались в S-фазе, что отражалось в ингибировании включения BrdU и снижении содержания ДНК в si-hSMAC-TT (таблица S1). Присутствие SMAC/Diablo в ядре и его роль в синтезе PL (B, 6C и 6F; таблица S1; обсуждается ниже) согласуется с наблюдением, что во время S-фазы уровни PL внутри ядра снижались. .38

Сайленсинг SMAC/Diablo в опухолях привел к широко измененной экспрессии генов, связанных с внеклеточным матриксом, экзосомами и белками в просвете ER и аппарата Гольджи, связанными с образованием везикул (A, 7B и 7D; Table S4). Эти изменения могут указывать на роль SMAC/Diablo в везикулярном транспорте, высвобождении экзосом и отложении внеклеточного матрикса. Экзосомный груз может включать факторы, служащие внеклеточными мессенджерами, опосредующие межклеточную коммуникацию и способствующие прогрессированию рака и метастазированию, 39, 40, а также факторы, участвующие в регуляции стромальной активности и микроокружения рака.Действительно, сайленсинг SMAC/Diablo также влиял на несколько факторов, связанных со стромальной активностью (таблица S4). si-hSMAC-A-TT показали сниженную экспрессию генов, связанных с воспалением, включая цитокины, хемокины и родственные им рецепторы, а также внутриклеточные белки, связанные с воспалительными и иммунными реакциями (таблица S6). Изменения в экспрессии этих генов в основном связаны со снижением онкогенности и инвазивности.

Сайленсинг SMAC/Diablo также был связан с модифицированной экспрессией переносчиков метаболитов и ионов и ферментов, участвующих в метаболизме (рис. S8A и S8B; таблица S5).К ним относятся дегидрогеназы и деаминазы, связанные с синтезом холестерина, липидов и нуклеотидов, метаболизмом аминокислот, биосинтезом олигосахаридов и гликозилированием белков. Таким образом, ингибирование роста клеток и опухолей может быть результатом метаболической дисрегуляции. В этом отношении сообщалось, что большинство затронутых генов связаны с различными видами рака, и здесь мы показали связь с раком легких (таблица S4).

Морфологические изменения, ведущие к появлению железистой/альвеолоподобной структуры в опухолях, заглушенных для экспрессии SMAC/Diablo -ТЦ.Раковые клетки A549 считаются AT2-подобными клетками.28 Клетки AT2 являются основным источником обновления дистального эпителия легких и могут либо регенерировать в клетки AT2, либо дифференцироваться в клетки AT1.24 Экспрессия предполагаемого маркера клеток AT1 подопланина24 и изменения в клеточная морфология с удлиненными ядрами в si-hSMAC-A-TT (D и 4E) подтверждает представление о том, что AT2-подобные клетки A549 подвергаются дифференцировке в клетки AT1 при снижении экспрессии SMAC/Diablo.

Более того, эти AT1-подобные клетки располагались на периферии альвеолоподобной структуры рядом с эндотелиальными клетками, визуализируемыми при окрашивании CD31 (G).Напротив, организация эндотелиальных клеток в si-NT-TT обычно отражает продолжающийся опухолевый ангиогенез. Эти данные свидетельствуют о том, что снижение экспрессии SMAC/Diablo запускает дифференцировку AT2 в клетки AT1 и морфологическую реорганизацию в структуры, подобные альвеолам легких (H).

Прогрессирование рака связано со стромальной активностью41, характеризующейся повышенным отложением изоформ коллагена, ламинина и фибронектина и продукцией гепарансульфата, а также ферментов деградации внеклеточного матрикса (ECM) и металлопротеиназ (MMPs).Снижение уровней SMAC/Diablo в опухолях также изменяет формирование стромы (14). Как и ожидалось для опухолей, si-NT-TT показали тонкую сеть, рассредоточенную по всей опухоли и обогащенную сосудистыми образованиями, при этом оба поддерживали развитие опухоли (A и 5B). С другой стороны, массивные фиброзные структуры, напоминающие рубцовую ткань, были обнаружены в si-hSMAC-A-TT (A). Эти стромальные структурные различия между экспрессирующими и неэкспрессирующими тканями SMAC/Diablo могут быть результатом сниженной экспрессии α-SMA, маркера CAF (E).Это, наряду с активностью фибробластов (выявленной с помощью окрашивания виментином и сирусом красным), указывает на нераковую стромальную активность в si-hSMAC-TT, такую ​​как образование рубцов при заживлении ран.

Наконец, ультраструктурный анализ si-NT- и si-hSMAC-A-TT четко продемонстрировал заметные изменения во внутриклеточных органеллах, включая ядро ​​(D и S9). Эти изменения включали уменьшение количества внутриклеточных везикул разного размера и плотности, таких как пластинчатые тела, накапливающие сурфактант, и другие типы везикул в si-hSMAC-A-TT (D и S9).Пластинчатые тельца представляют собой секреторные органеллы, обнаруженные в клетках AT2, которые хранят легочный сурфактант и состоят на 60–70% из PC.42 Как обсуждается ниже, наши результаты показывают, что морфологические изменения, наблюдаемые в si-hSMAC-A-TT, связаны с SMAC/ Функция Diablo в синтезе PL.

Повышенная экспрессия SMAC/Diablo при раке регулирует синтез липидов экзосом были модифицированы (A и 7B; таблица S4).Кроме того, были изменены уровни экспрессии генов, кодирующих несколько ферментов, связанных с транспортом, синтезом, деградацией и регуляцией холестерина и липидов (C и 7F). К ним относятся StARD10, связанный с переносом липидов, липаза LIPH, фосфолипаза C, ацилглицерол-3-фосфат-О-ацилтрансфераза, ELOV4 и ELOV3, и ATP10B (P4-ATPase), флиппаза PL, которая может изменять форму клеток и которая ингибирует клеточную адгезию и распространение и, таким образом, может быть связано с морфологическими изменениями, вызванными сайленсингом SMAC/Diablo.Более того, анализ PL и, в частности, содержания PC показал значительное снижение (40–50%) si-hSMAC-A-TT по сравнению с si-NT-TT (E). PC синтезируется двумя основными различными путями: путем

de novo или цитидиндифосфат (CDP)-холин (Кеннеди) и путем PE метилтрансферазы (PEMT), включающим тройное метилирование PE, осуществляемое одним ферментом, PEMT. .43 Ферменты, участвующие в биосинтезе PC, расположены на митохондриально-ассоциированных мембранах (MAM), где происходит транспорт между ER и митохондриями (4).Наши результаты показывают снижение экспрессии ключевых ферментов пути Кеннеди и повышение экспрессии PEMT (G). SMAC/Diablo в IMS может влиять на синтез PL посредством фосфатидилсериндекарбоксилазы (PISD), фермента внутренней митохондриальной мембраны, обращенного к IMS. PISD катализирует превращение PS в PE с высвобождением CO ₂ ,44, после чего PE превращается в PC в ER (). В связи с этим недавно была представлена ​​связь между митохондриальным метаболизмом липидов и программой дифференцировки клеток рака молочной железы, включающей модуляцию синтеза митохондриального PE.45

Схематическое изображение влияния истощения SMAC/Diablo на морфологию и свойства опухоли

(A) Представлено схематическое изображение митохондрий в клетках рака легкого с предполагаемыми функциями сверхэкспрессии SMAC/Diablo в регуляции и поддержании фосфолипидов выделен синтез. Основное место синтеза фосфолипидов находится в местах контакта ER-митохондрий (MAM), показанных с указанием ключевых белков. К ним относятся инозитол-3-фосфатный рецептор типа 3 (IP ₃ R3), сигма-рецептор 1 (Sig1R) (ретикулярный шаперон), связывающий белок иммуноглобулина (BiP), шаперон ER HSP70, белок 75, регулируемый глюкозой (GRP75). , и другие.55 Ключевые ферменты биосинтеза липидов, такие как диацилглицерол-O-ацилтрансфераза 2 (DGAT2), фосфатидилэтаноламин-N-метилтрансфераза (PEMT), фосфатидилсеринсинтаза (PSS) и фосфатидатцитидилилтрансфераза 1 (CDS1), присутствуют в высоких концентрациях в МАМ, 56, 57, что указывает на роль этой структуры в биосинтезе и транспортировке липидов. Глицерол-3-фосфатацилтрансфераза 1, митохондриальная (GPAM), расположена на внешней митохондриальной мембране (OMM) в MAM. Фосфатидилсерин (PS) вырабатывается в ER, но его необходимо перенести в митохондрии, где он превращается в фосфатидилэтаноламин (PE).Затем PE перемещается обратно в ER, где он превращается в фосфатидилхолин (PC). Также показан перенос ацил-КоА через OMM через VDAC1 в IMS, где они превращаются в ацилкарнитин с помощью CPT1a для дальнейшего процессинга путем β-окисления, и транспортный комплекс холестерина, состоящий из Star, VDAC1 и TSPO. (B) Истощение SMAC/Diablo с использованием специфического si-SMAC приводит к уменьшению образования везикул и ингибированию пролиферации клеток и синтеза фосфолипидов. Истощение SMAC/Diablo также изменяет ядерную морфологию, стромальную структуру и микроокружение рака, а также экспрессию генов, связанных с клеточной мембраной, экзосомами и белками, связанными с ER и Гольджи.Это приводит к изменениям в организации кровеносных капилляров, дифференцировке AT2-подобных клеток в AT1-подобные клетки и уменьшению образования пластинчатых тел. Наконец, эти изменения приводят к морфологическим изменениям, выражающимся в формировании железистых/альвеолоподобных структур.

Другим важным открытием является снижение экспрессии SLC44A4 в si-hSMAC-A-TT (рисунок S8A). SLC44A4 обнаружен как в плазматических, так и в митохондриальных мембранах, где он транспортирует холин с высоким сродством Na ⁺ -независимым образом. 46 SLC44A4 поставляет холин для синтеза PC. Таким образом, SLC44A4 физиологически важен для синтеза мембран во время роста или восстановления клеток, и, учитывая его роль в продукции PL, для образования легочных сурфактантов. Сообщалось об усиленном транспорте холина в раковых клетках, где предполагалось, что он играет роль в повышении PC. Действительно, повышение общего уровня холина является одной из наиболее широко установленных характеристик раковых клеток.47 Аберрантный метаболизм холина, наблюдаемый в раковых клетках, сильно коррелирует с их злокачественным прогрессированием.48 Соответственно, члены семейства SLC44 были предложены в качестве новых молекулярных мишеней для терапии рака. .49 Все эти ферменты и транспортеры были подавлены в si-hSMAC-A-TT (F и S8A).

SMAC/Diablo Ядерная локализация и влияние ее истощения на структуру, деление и функцию ядра

Присутствие PL в хроматине и ядерном матриксе и роль ядерных PL в структурной организации хроматина и синтезе нуклеиновых кислот продемонстрировал. 50 Поскольку внутриядерные PL регулируют репликацию ДНК,38 изменения, наблюдаемые в экспрессии многих генов при подавлении экспрессии SMAC/Diablo (таблицы S4-S6), могут быть результатом снижения уровней PL в клетке (; таблица S1) и, таким образом, в ядре. Необходимы дальнейшие исследования для оценки связи между высокими уровнями экспрессии SMAC/Diablo при раке и его функцией в регуляции уровней ядерных PL и их регуляции репликации ДНК.38

Интересно, что было показано, что SMAC/Diablo взаимодействует с двумя ядерными белками, ядерный транслокатор арилуглеводородного рецептора (ARNT), также известный как кислород-независимая β-субъединица факторов, индуцируемых гипоксией (HIF-1β), и коактиватор транскрипции, подобный Mastermind, MAML2.51 Для выполнения своей транскрипционной функции HIFs должны образовывать гетеродимер между кислород-зависимой α-субъединицей (HIF-1α или HIF-2α) и кислород-независимой субъединицей (HIF-1β). Димер HIF-2α-ARNT участвует в адаптации клеток к кислородному стрессу, связанному с ростом и прогрессированием опухоли. ARNT также необходим для ядерной локализации репрессоров транскрипции NPAS1 и NPAS3.52 MAML2, как коактиватор транскрипции, играет важную роль в передаче сигналов Notch, регулируя множественные пути развития.53 MAML2 связывается с белками как циклический белок, связывающий элемент ответа AMP (CREB), связывающий белок (CBP).

Таким образом, поскольку ядерный SMAC/Diablo связывает HIF-1β (ARNT) и MAML2, он может конкурировать с HIF-1α, HIF-2α, NPAS1 или NPAS3 за связывание с ARNT. Точно так же, связывая MAML2, SMAC/Diablo препятствует взаимодействию MAML2 с CBP. Эти эффекты SMAC/Diablo уменьшались при подавлении экспрессии SMAC/Diablo. Это, вместе с SMAC/Diablo-опосредованной регуляцией синтеза PL и учитывая то, как ядерные PL контролируют структуру и функцию ядра, объясняет, почему подавление экспрессии SMAC/Diablo будет влиять на множественные сигнальные пути.

Новые результаты, представленные в этом исследовании, показывают, что сниженная экспрессия SMAC/Diablo в раковых клетках приводит к изменениям в экспрессии генов, связанных с клеточной мембраной, образованием везикул, белками, связанными с ER и Гольджи, ультраструктурой клетки и PL. транспорт и синтез объединены и представлены в схематической модели (). Таким образом, представленные здесь результаты показывают, что SMAC/Diablo, сверхэкспрессируемый при многих видах рака, выполняет дополнительные неапоптотические функции, способствуя выживанию раковых клеток.Снижение экспрессии SMAC/Diablo ингибировало рост раковых клеток как в культуре, так и в опухолях. Более того, остаточные опухоли легких, обработанные si-SMAC, показали реорганизацию ткани с образованием альвеолярных структур при дифференцировке AT2-подобных опухолевых клеток в AT1-подобные клетки. Похоже, что сайленсинг SMAC/Diablo приводит к реактивации «памяти» о физиологических и морфологических особенностях альвеол, включая реорганизацию эндотелиальных клеток хозяина (F и S6). Сотни генов, которые, как показано, по-разному экспрессируются в si-hSMAC-TT, связаны с широким спектром клеточных и тканевых морфологических признаков и функций, свидетельствующих о неапоптотических функциях SMAC/Diablo, необходимых для онкогенеза.

Учитывая, что многие пациенты нечувствительны к различным методам лечения, включая таргетные методы лечения, такие как иммунотерапия и ингибирование ангиогенеза,54 крайне необходимо разработать новые терапевтические стратегии. Таким образом, роль SMAC/Diablo в синтезе PL, жизненно важного для роста и функционирования раковых клеток, является потенциальной мишенью для разработки новых терапевтических подходов к лечению рака.

Материалы и методы

Подробные экспериментальные процедуры см. в дополнительных материалах и методах.

Культура клеток и трансфекция

Тринадцать клеточных линий, представляющих различные виды рака, и пять незлокачественных клеточных линий или первичные культуры выращивали в соответствующей среде и поддерживали во влажной атмосфере при 37°C с 5% CO ₂ , как описано в дополнительных материалах и методах. siRNA, специфичная для SMAC/Diablo человека (si-hSMAC-A; смысловая 5′-AAGCGGUGUUUCUCAGAATTGtt-3′ и антисмысловая 5′-AACAAUUCUGAGAAACCCGCtt-3′), а также три другие siRNA, нацеленные на SMAC/Diablo (B–D), как а также нецелевые миРНК (si-NT) были разработаны (см. Дополнительные материалы и методы) и синтезированы компанией Genepharma (Сучжоу, Китай).Клетки высевали (150 000 клеток/лунку) в 6-луночные культуральные планшеты, культивировали до слияния 40–60% и трансфицировали 10–100 нМ si-NT или si-hSMAC с использованием реагента для трансфекции JetPRIME (Illkirch, Франция). в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ пролиферации клеток SRB

Через 24 часа после трансфекции si-NT или si-hSMAC клетки (10 000/лунку) подсчитывали и высевали в 96-луночные планшеты. Еще через 48, 72 или 96 часов клетки промывали PBS, фиксировали 10% трихлоруксусной кислотой и окрашивали SRB.SRB экстрагировали из клеток с использованием 100 мМ Tris-основания, а поглощение при 510 нм определяли с помощью планшет-ридера Infinite M1000 (Tecan, Маннедорф, Швейцария).

Эксперименты с ксенотрансплантатом

Клетки рака легкого A549 (3 × 10 ⁶ ) или рака молочной железы MDA-MB231 (3 × 10 ⁶ ) подвергали п/к. инокулировали в бока задних конечностей 6-недельных бестимусных самцов бестимусных мышей. Когда объем опухоли достигал 75–90 мм ³ , мышей рандомизировали на 2 или 3 группы и обрабатывали si-NT или si-hSMAC, смешанным с реагентом JetPEI, который вводили в установленные s.в. опухоли (350 или 700 нМ, конечная концентрация) каждые 3 дня. В конце экспериментов мышей умерщвляли, а опухоли вырезали и обрабатывали для ИГХ или замораживали в жидком азоте для иммуноблоттинга и выделения РНК, как описано в Дополнительных материалах и методах. Экспериментальные протоколы были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных.

ИГХ, иммунофлуоресценция и иммуноблоттинг

Фиксированные формалином, залитые в парафин срезы si-NT- или si-hSMAC-TT окрашивали H&E или зондировали соответствующими антителами с помощью ИГХ или иммунофлуоресцентного окрашивания (см. Дополнительные материалы и методы) .

Экстракция и анализ липидов

Экстракцию липидов из si-NT-TT и si-SMAC-TT и количественный анализ PL и PC проводили, как описано в дополнительных материалах и методах.

Подготовка РНК, кПЦР и NGS

Тотальную РНК выделяли из si-NT- или si-hSMAC-A-TT, а полученную кДНК подвергали анализу NGS или кПЦР, как описано в дополнительных материалах и методах.

Образцы, полученные от пациентов

Образцы крови с ХЛЛ были получены в Медицинском центре Университета Сорока от пациентов, не получавших никакого лечения, в то время как РВМС были выделены, как описано в Дополнительных материалах и методах.Образцы свежей раковой и нераковой ткани легкого были получены от одних и тех же пациентов с раком легкого и немедленно заморожены в жидком азоте до анализа на экспрессию SMAC/Diablo. Исследования были одобрены Консультативным комитетом Медицинского центра Университета Сорока.

Статистика и анализ данных

Статистическая значимость указывается при *p<0,05, **p<0,01 или ***p<0,001.

Vesiclepedia: сводка генов

Описание гена для DIABLO
Название гена	diablo, IAP-связывающий митохондриальный белок
Символ гена	ДИАБЛО
Другие имена/псевдонимы	DFNA64 ДИАБЛО-С SMAC SMAC3
Виды	Человек разумный
Перекрестные ссылки в базе данных — DIABLO
Vesiclepedia	VP_56616
ЭкзоКарта	ЭкзоКарта_56616
Энтрез Джин	56616
ХГНК	21528
МИМ	605219
DIABLO, идентифицированный во внеклеточных везикулах, происходящих из следующих типов тканей/клеток
В-клетки [Микрочастицы]      Подробнее >>>	16342139
Раковые клетки головного мозга [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Раковые клетки головного мозга [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Раковые клетки головного мозга [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Раковые клетки головного мозга [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Раковые клетки головного мозга [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки рака молочной железы [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки колоректального рака [Микровезикулы]      Подробнее >>>	19	0
Клетки колоректального рака [Экзосомы/Внеклеточные везикулы/Микровезикулы]      Подробнее >>>	23230278
Клетки колоректального рака [Экзосомы/Внеклеточные везикулы/Микровезикулы]      Подробнее >>>	23230278
Клетки колоректального рака [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки колоректального рака [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки колоректального рака [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки глиобластомы [Микровезикулы]      Подробнее >>>	1 22
Клетки рака почки [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки меланомы [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки меланомы [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки меланомы [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки меланомы [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки рака яичников [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки рака яичников [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки рака яичников [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Клетки рака яичников [Внеклеточные везикулы]      Подробнее >>>	278
Плазма [Микрочастицы]      Подробнее >>>	23056467
Описание экспериментов по выявлению DIABLO во внеклеточных везикулах
1 Идентификатор эксперимента 308 Идентифицированная молекула белок Внеклеточный везикулярный тип Микрочастицы Метод идентификации Масс-спектрометрия [MALDI TOF/TOF] Масс-спектрометрия [Q-TOF] Идентификатор PubMed 16342139 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомный анализ микрочастиц мембран злокачественных лимфоцитов с использованием оптимизации охвата двойной ионизацией Авторы Miguet L, Pacaud K, Felden C, Hugel B, Martinez MC, Freyssinet JM, Herbrecht R, Potier N, van Dorsselaer A, Mauvieux L Название журнала протеомика Год публикации 2006 Образец В-клетки Название образца В-клетки — пациент с хроническим В-клеточным лимфоидом Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [MALDI TOF/TOF] Масс-спектрометрия [QTOF] EV-ТРЕК —
2 Идентификатор эксперимента 580 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Раковые клетки головного мозга Наименование образца Т-47Д Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
3 Идентификатор эксперимента 581 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Раковые клетки головного мозга Наименование образца SF268 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
4 Идентификатор эксперимента 583 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Раковые клетки головного мозга Наименование образца SF539 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
5 Идентификатор эксперимента 584 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Раковые клетки головного мозга Наименование образца СНБ-19 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
6 Идентификатор эксперимента 585 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Раковые клетки головного мозга Наименование образца СНБ-75 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
7 Идентификатор эксперимента 577 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки рака молочной железы Наименование образца MCF7 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
8 Идентификатор эксперимента 303 Идентифицированная молекула мРНК Тип внеклеточных везикул Микровезикулы Метод идентификации Микрочип [Illumina] Идентификатор PubMed 19 0 Организм Человек разумный Описание эксперимента Микровезикулы, полученные из клеток колоректального рака, обогащены мРНК, связанными с клеточным циклом, которые способствуют пролиферации эндотелиальных клеток Авторы Hong BS, Cho JH, Kim H, Choi EJ, Rho S, Kim J, Kim JH, Choi DS, Kim YK, Hwang D, Gho YS Название журнала Геномика BMC Год издания 2009 Образец Клетки колоректального рака Наименование образца SW480 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Ультрафильтрация Градиент плотности OptiPrep Плотность флотации 1. 09 г/мл Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок мРНК Методы исследования Вестерн-блоттинг ОТ-ПЦР Микрочип [Illumina] EV-ТРЕК —
9 Идентификатор эксперимента 487 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Экзосомы/внеклеточные везикулы/микровезикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия Идентификатор PubMed 23230278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Две различные популяции экзосом выделяются из органоидов, полученных из клеток карциномы толстой кишки LIM1863. Авторы Тауро Б.Дж., Грининг Д.В., Матиас Р.А., Мативанан С., Джи Х., Симпсон Р.Дж. Название журнала Мол клеточная протеомика Год издания 2012 Образец Клетки колоректального рака Название образца EpCAM аффинно очищенные экзосомы-клетки колоректального рака (LIM1863) Методы выделения/очистки — Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы исследования Масс-спектрометрия EV-ТРЕК EV130020: EV-МЕТРИЧЕСКИЙ: 38%
10 Идентификатор эксперимента 488 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Экзосомы/внеклеточные везикулы/микровезикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия Идентификатор PubMed 23230278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Две различные популяции экзосом выделяются из органоидов, полученных из клеток карциномы толстой кишки LIM1863. Авторы Тауро Б.Дж., Грининг Д.В., Матиас Р.А., Мативанан С., Джи Х., Симпсон Р.Дж. Название журнала Мол клеточная протеомика Год издания 2012 Образец Клетки колоректального рака Название образца Везикулы слущивания – клетки колоректального рака (LIM1863) Методы выделения/очистки — Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы исследования Масс-спектрометрия EV-ТРЕК EV130020: EV-МЕТРИЧЕСКИЙ: 38%
11 Идентификатор эксперимента 587 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки колоректального рака Наименование образца Colo205 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
12 Идентификатор эксперимента 588 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки колоректального рака Наименование образца HCC 2998 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
13 Идентификатор эксперимента 590 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки колоректального рака Наименование образца HCT-15 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
14 ID эксперимента 203 Идентифицированная молекула мРНК Тип внеклеточных везикул Микровезикулы Метод идентификации Микрочип Идентификатор PubMed 1 22 Организм Человек разумный Описание эксперимента Микровезикулы глиобластомы транспортируют РНК и белки, которые способствуют росту опухоли и обеспечивают диагностические биомаркеры Авторы Skog J, Wüer T, van Rijn S, Meijer DH, Gainche L, Sena-Esteves M, Curry WT Jr, Carter BS, Krichevsky AM, Breakefield XO Название журнала Нат клеточный биол Год издания 2008 Образец Клетки глиобластомы Название образца Клетки глиобластомы Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Ультрацентрифугирование Фильтрация Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок миРНК мРНК Методы, использованные в исследовании ОТ-ПЦР Массив антител Микрочип EV-ТРЕК —
15 Идентификатор эксперимента 598 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки рака почки Наименование образца RXF 393 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
16 Идентификатор эксперимента 617 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки меланомы Наименование образца LOX IMVI Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
17 Идентификатор эксперимента 618 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки меланомы Название образца M14 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
18 Идентификатор эксперимента 619 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки меланомы Наименование образца МАЛМЭ-3М Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
19 Идентификатор эксперимента 623 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки меланомы Наименование образца SK-MEL-5 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
20 Идентификатор эксперимента 628 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки рака яичников Наименование образца ОВКАР-4 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
21 Идентификатор эксперимента 629 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки рака яичников Наименование образца ОВКАР-5 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
22 Идентификатор эксперимента 631 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки рака яичников Наименование образца СК-ОВ-3 Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
23 Идентификатор эксперимента 632 Идентифицированная молекула белок Тип внеклеточных везикул Внеклеточные везикулы Метод идентификации Масс-спектрометрия [LTQ] Идентификатор PubMed 278 Организм Человек разумный Описание эксперимента Протеомное профилирование внеклеточных везикул NCI-60 выявляет общий белковый груз и биомаркеры, специфичные для типа рака. Авторы Гурвиц С.Н., Райдер М.А., Банди Дж.Л., Лю С., Сингх Р.К., Мекес Д.Г. мл. Название журнала Онкотаргет Год издания 2016 Образец Клетки рака яичников Наименование образца NCI-ADR-RES Методы выделения/очистки Дифференциальное центрифугирование Преципитация на полимерной основе Ультрацентрифугирование Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы, использованные в исследовании Масс-спектрометрия [LTQ] EV-ТРЕК —
24 Идентификатор эксперимента 473 Идентифицированная молекула белок Внеклеточный везикулярный тип Микрочастицы Метод идентификации Масс-спектрометрия Идентификатор PubMed 23056467 Организм Человек разумный Описание эксперимента Причина или следствие артериогенеза: композиционные изменения микрочастиц у пациентов с ИБС, проходящих терапию внешней контрпульсацией. Авторы Аль Кааби А., Траупе Т., Штутц М., Букс Н., Хеллер М. Название журнала PLoS один Год издания 2012 Образец Плазма Наименование образца Пациенты с наружной контрпульсационной терапией-Кровь Методы выделения/очистки — Плотность флотации — Молекулы, идентифицированные в исследовании Белок Методы исследования Масс-спектрометрия EV-ТРЕК —

Высокая экспрессия Smac/DIABLO связана с ранним локальным рецидивом рака шейки матки | BMC Рак

1.

Урен А.Г., Коулсон Э.Дж., Во Д.Л.: Сохранение бакуловирусного ингибитора белков повторов апоптоза (BIRP) в вирусах, нематодах, позвоночных и дрожжах. Тенденции биохимических наук. 1998, 23 (5): 159-162. 10.1016/С0968-0004(98)01198-0.

КАС Статья пабмед Google Scholar

2.

Shi Y: Механизмы активации и ингибирования каспаз во время апоптоза. Мол Ячейка. 2002, 9 (3): 459-470. 10.1016/С1097-2765(02)00482-3.

КАС Статья пабмед Google Scholar

3.

Wang X: Растущая роль митохондрий в апоптозе. Гены Дев. 2001, 15 (22): 2922-2933.

КАС пабмед Google Scholar

4.

Deveraux QL, Reed JC: Белки семейства IAP — супрессоры апоптоза. Гены Дев. 1999, 13 (3): 239-252.

КАС Статья пабмед Google Scholar

5.

Shi Y: Консервативный тетрапептидный мотив: усиление апоптоза посредством связывания IAP. Смерть клеток 2002, 9 (2): 93-95. 10.1038/sj/cdd/4400957.

КАС Статья пабмед Google Scholar

6.

Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X: Smac, митохондриальный белок, который способствует активации цитохром с-зависимой каспазы путем устранения ингибирования IAP. Клетка. 2000, 102 (1): 33-42. 10.1016/S0092-8674(00)00008-8.

КАС Статья пабмед Google Scholar

7.

Verhagen AM, Ekert PG, Pakusch M, Silke J, Connolly LM, Reid GE, Moritz RL, Simpson RJ, Vaux DL: Идентификация DIABLO, белка млекопитающих, который способствует апоптозу путем связывания с белками IAP и противодействия им. Клетка. 2000, 102 (1): 43-53. 10.1016/S0092-8674(00)00009-Х.

КАС Статья пабмед Google Scholar

8.

Srinivasula SM, Datta P, Fan XJ, Fernandes-Alnemri T, Huang Z, Alnemri ES: Молекулярные детерминанты каспазо-стимулирующей активности Smac/DIABLO и ее роль в пути рецептора смерти. Дж. Биол. Хим. 2000, 275 (46): 36152-36157. 10.1074/jbc.C000533200.

КАС Статья пабмед Google Scholar

9.

Song Z, Yao X, Wu M: Прямое взаимодействие между сурвивином и Smac/DIABLO необходимо для антиапоптотической активности сурвивина во время таксол-индуцированного апоптоза. Дж. Биол. Хим. 2003, 278 (25): 23130-23140. 10.1074/jbc.M300957200.

КАС Статья пабмед Google Scholar

10.

Vucic D, Deshayes K, Ackerly H, Pisabarro MT, Kadkodayan S, Fairbrother WJ, Dixit VM: SMAC отрицательно регулирует антиапоптотическую активность меланомного ингибитора апоптоза (ML-IAP). Дж. Биол. Хим. 2002, 277 (14): 12275-12279. 10.1074/jbc.M112045200.

КАС Статья пабмед Google Scholar

11.

Yang QH, Du C: Smac/DIABLO избирательно снижает уровни c-IAP1 и c-IAP2, но не XIAP и ливина в клетках HeLa. Дж. Биол. Хим. 2004, 279 (17): 16963-16970. 10.1074/jbc.M401253200.

КАС Статья пабмед Google Scholar

12.

Yang L, Cao Z, Yan H, Wood WC: Сосуществование высоких уровней апоптотической сигнализации и ингибиторов апоптозных белков в опухолевых клетках человека: значение для специфической терапии рака. Рак рез. 2003, 63 (20): 6815-6824.

КАС пабмед Google Scholar

13.

Танака К., Ивамото С., Гон Г., Нохара Т., Ивамото М., Танигава Н.: Экспрессия сурвивина и его связь с потерей апоптоза при карциномах молочной железы. Клин Рак Рез. 2000, 6 (1): 127-134.

КАС пабмед Google Scholar

14.

Ferreira CG, van der Valk P, Span SW, Jonker JM, Postmus PE, Kruyt FA, Giaccone G: Оценка IAP (ингибиторов апоптоза) белков как предикторов ответа на химиотерапию больных клеточным раком легкого. Энн Онкол. 2001, 12 (6): 799-805. 10.1023/А:1011167113067.

КАС Статья пабмед Google Scholar

15.

Hong X, Lei L, Glas R: Опухоли приобретают устойчивость к апоптозу, опосредованному ингибитором белка апоптоза (IAP), за счет измененной специфичности цитозольного протеолиза. J Эксперт Мед. 2003, 197 (12): 1731-1743. 10.1084/ем.20020801.

КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

16.

Sekimura A, Konishi A, Mizuno K, Kobayashi Y, Sasaki H, Yano M, Fukai I, Fujii Y: Экспрессия Smac/DIABLO является новым прогностическим маркером рака легких. Oncol Rep. 2004, 11 (4): 797-802.

КАС пабмед Google Scholar

17.

Mizutani Y, Nakanishi H, Yamamoto K, Li YN, Matsubara H, Mikami K, Okihara K, Kawauchi A, Bonavida B, Miki T: Снижение экспрессии Smac/DIABLO при почечно-клеточном раке и его прогностическое значение . Дж. Клин Онкол. 2005, 23 (3): 448-454. 10.1200/JCO.2005.02.191.

КАС Статья пабмед Google Scholar

18.

Espinosa M, Cantu D, Lopez CM, De la Garza JG, Maldonado V, Melendez-Zajgla J: SMAC экспрессируется de novo в подмножестве опухолей рака шейки матки. БМК Рак. 2004, 4 (1): 84-10.1186/1471-2407-4-84.

Артикул пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

19.

Yoo NJ, Kim HS, Kim SY, Park WS, Park CH, Jeon HM, Jung ES, Lee JY, Lee SH: Иммуногистохимический анализ экспрессии Smac/DIABLO в карциномах и саркомах человека. Апмис. 2003, 111 (3): 382-388. 10.1034/j.1600-0463.2003.t01-1-1110202.x.

КАС Статья пабмед Google Scholar

20.

Cantu De Leon D, Lopez-Graniel C, Frias Mendivil M, Chanona Vilchis G, Gomez C, De La Garza Salazar J: Значение плотности микрососудов (MVD) при рецидиве рака шейки матки. Int J Gynecol Рак. 2003, 13 (6): 856-862. 10.1111/j.1525-1438.2003.13399.х.

КАС Статья пабмед Google Scholar

21.

Эван Г.И., Вусден К.Х.: Пролиферация, клеточный цикл и апоптоз при раке. Природа. 2001, 411 (6835): 342-348. 10.1038/35077213.

КАС Статья пабмед Google Scholar

22.

Strasser A, Huang DC, Vaux DL: Роль семейства генов bcl-2/ced-9 в раке и общие последствия дефектов в контроле гибели клеток для онкогенеза и устойчивости к химиотерапии.Биохим Биофиз Акта. 1997, 1333 (2): F151-78.

КАС пабмед Google Scholar

23.

Nachmias B, Ashhab Y, Ben-Yehuda D: Ингибитор семейства белков апоптоза (IAP): новая терапевтическая мишень при раке. Семин Рак Биол. 2004, 14 (4): 231-243. 10.1016/j.semcancer.2004.04.002.

КАС Статья пабмед Google Scholar

24.

Schimmer AD: Ингибитор белков апоптоза: перевод базовых знаний в клиническую практику.Рак рез. 2004, 64 (20): 7183-7190. 10.1158/0008-5472.CAN-04-1918.

КАС Статья пабмед Google Scholar

25.

Espinosa M, Cantu D, Herrera N, Lopez CM, De la Garza JG, Maldonado V, Melendez-Zajgla J: Ингибиторы белков апоптоза при раке шейки матки человека. БМК Рак. 2006, 6: 45-10.1186/1471-2407-6-45.

Артикул пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

26.

Roberts DL, Merrison W, MacFarlane M, Cohen GM: Ингибитор апоптозного белка, связывающего домен Smac, не является существенным для его проапоптотической активности. Джей Селл Биол. 2001, 153 (1): 221-228. 10.1083/jcb.153.1.221.

КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

27.

MacFarlane M, Merrison W, Bratton SB, Cohen GM: Опосредованная протеасомами деградация Smac во время апоптоза: XIAP способствует убиквитинированию Smac in vitro. Дж. Биол. Хим. 2002, 277 (39): 36611-36616. 10.1074/jbc.M200317200.

КАС Статья пабмед Google Scholar

28.

Morizane Y, Honda R, Fukami K, Yasuda H: X-связанный ингибитор апоптоза действует как убиквитинлигаза по отношению к зрелой каспазе-9 и цитозольному Smac/DIABLO. J Biochem (Токио). 2005, 137 (2): 125-132.

КАС Статья Google Scholar

29.

Yoon K, Jang HD, Lee SY: Прямое взаимодействие Smac с NADE способствует индуцируемому TRAIL апоптозу. Biochem Biophys Res Commun. 2004, 319 (2): 649-654. 10.1016/j.bbrc.2004.05.043.

КАС Статья пабмед Google Scholar

30.

Malhi H, Gores GJ: Сопротивление TRAIL приводит к прогрессированию рака: TRAIL к погибели?. Онкоген. 2006

Google Scholar

31.

Березовская О., Шиммер А. Д., Глинский А.Б., Пинилла С., Хоффман Р.М., Рид Дж.С., Глинский Г.В.: Повышенная экспрессия белка-ингибитора апоптоза XIAP способствует устойчивости к аноикису циркулирующих клеток-предшественников метастазов рака предстательной железы человека. Рак рез. 2005, 65 (6): 2378-2386. 10.1158/0008-5472.CAN-04-2649.

КАС Статья пабмед Google Scholar

32.

Kosary CL: Стадия FIGO, гистология, гистологическая степень, возраст и раса как прогностические факторы в определении выживаемости при раке женской гинекологической системы: анализ 1973-87 SEER случаев рака эндометрия, шейки матки, яичник, вульва и влагалище.Семин Хирург Онкол. 1994, 10 (1): 31-46.

КАС Статья пабмед Google Scholar

33.

Lea JS, Sheets EE, Wenham RM, Duska LR, Coleman RL, Miller DS, Schorge JO: Стадия IIB-IVB аденокарциномы шейки матки: прогностические факторы и выживаемость. Гинекол Онкол. 2002, 84 (1): 115-119. 10.1006/гинек.2001.6473.

Артикул пабмед Google Scholar

34.

Куинн М.А.: Аденокарцинома шейки матки – есть ли аргументы в пользу другой тактики лечения?Curr Opin Obstet Gynecol. 1997, 9 (1): 21-24.

КАС Статья пабмед Google Scholar

35.

Kuai J, Nickbarg E, Wooters J, Qiu Y, Wang J, Lin LL: Эндогенная ассоциация TRAF2, TRAF3, cIAP1 и Smac с бета-рецептором лимфотоксина раскрывает новый механизм апоптоза. Дж. Биол. Хим. 2003, 278 (16): 14363-14369. 10.1074/jbc.M208672200.

КАС Статья пабмед Google Scholar

DIABLO — гомолог Diablo, митохондриальный предшественник — Homo sapiens (человек)

С этой записью сопоставлено 8 потенциальных изоформ.

	A0A024RBT2	A0A024RBT2_HUMAN		Диабло гомолог, митохондриальная Диабло гомолог, митохондриальная	DIABLO hCG_1782202	166	Оценка аннотации: Оценка аннотации: 2 из 5 Оценка аннотаций представляет собой эвристический показатель содержания аннотаций записи или протеома UniProtKB. Этот показатель не может использоваться в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка. Подробнее …
	H7BZQ7	H7BZQ7	H7BZQ7_HUMAN	Diablo Homolog, Mitochondrial Diablo Homolog, Mitochondrial	Diablo	127	Оценка за аннотацию: Оценка за аннотацию: 1 из 5 Оценка аннотаций представляет собой эвристический показатель содержания аннотаций записи или протеома UniProtKB.Этот показатель не может использоваться в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка. Подробнее …
	H7BZK7	H7BZK7_HUMAN		Diablo Homolog, Mitochondrial Diablo Homolog, Mitochondrial	Diablo	191	Оценка за аннотацию: Оценка за аннотацию: 1 из 5 Оценка аннотаций представляет собой эвристический показатель содержания аннотаций записи или протеома UniProtKB. Этот показатель не может использоваться в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка. Подробнее …
277	A0A2U3TZH3	A0A2U3TZH3_HUMAN		Diablo HomoLog, Mitochondrial Diablo Homolog, Mitochondrial	Diablo	209	Оценка за аннотацию: Оценка за аннотацию: 1 из 5 Оценка аннотаций представляет собой эвристический показатель содержания аннотаций записи или протеома UniProtKB.Этот показатель не может использоваться в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка. Подробнее …
	a0a2r8y5h3	a0a2r8y5h3h3_human		Diablo Homolog, Mitochondrial Diablo Homolog, Mitochondrial	Diablo	105	Оценка за аннотацию: Оценка за аннотацию: 1 из 5 Оценка аннотаций представляет собой эвристический показатель содержания аннотаций записи или протеома UniProtKB. Этот показатель не может использоваться в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка. Подробнее …
	F5GXT8	F5GXT8	F5GXT8	F5GXT8		Diablo Homolog, Mitochondrial Diablo Homolog, Mitochondrial	Diablo	46	Оценка за аннотацию: Оценка за аннотацию: 1 из 5 Оценка аннотаций представляет собой эвристический показатель содержания аннотаций записи или протеома UniProtKB.Этот показатель не может использоваться в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка. Подробнее …
	F5GX50	F5GX50_HUMAN		Diablo Homolog, Mitochondrial Diablo Homolog, Mitochondrial	Diablo	74	Оценка за аннотацию: Оценка за аннотацию: 1 из 5 Оценка аннотаций представляет собой эвристический показатель содержания аннотаций записи или протеома UniProtKB. Этот показатель не может использоваться в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка. Подробнее …
	F5gyh4	F5gyh4	F5gyh4_human		Diablo Homolog, Mitochondrial Diablo Homolog, Mitochondrial	Diablo	74	Оценка за аннотацию: Оценка за аннотацию: 1 из 5 Оценка аннотаций представляет собой эвристический показатель содержания аннотаций записи или протеома UniProtKB.Этот показатель не может использоваться в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка. Подробнее…

Diablo MGI Mouse Gene Detail — MGI:1

332-125
8 (-) (-)

Штамм	Идентификатор модели гена	Тип элемента	Координаты	Выберите штаммы
C57BL/6J	MGI_C57BL6J_1
белок, кодирующий ген	Хр5:123647828-123664825 (-)
129С1/СвИМЖ	MGP_129S1SvImJ_G0030074	белок, кодирующий ген	Хр5:127250652-127264398 (-)
А/Дж	MGP_AJ_G0030039	белок, кодирующий ген	Хр5:121975595-121989341 (-)
АКР/Дж	MGP_AKRJ_G0029975	белок, кодирующий ген	Хр5:125
БАЛБ/cJ	MGP_BALBcJ_G0030050	белок, кодирующий ген	Хр5:123308789-123322535 (-)
C3H/HeJ	MGP_C3HHeJ_G0029766	белок, кодирующий ген	Хр5:126522067-126537753 (-)
C57BL/6NJ	MGP_C57BL6NJ_G0030503	белок, кодирующий ген	Хр5:132185195-132200384 (-)
КАРОЛИ/EiJ	MGP_CAROLIEiJ_G0027728	белок, кодирующий ген	Хр5:116521159-116536470 (-)
КАСТ/EiJ	MGP_CASTEiJ_G0029176	белок, кодирующий ген	Хр5:125620617-125634221 (-)
ЦБА/Дж	MGP_CBAJ_G0029737	белок, кодирующий ген	Хр5:137381556-137395292 (-)
ДБА/2J	MGP_DBA2J_G0029886	белок, кодирующий ген	Хр5:1219	-122007627 (-)
ФВБ/Нью-Джерси	MGP_FVBNJ_G0029843	белок, кодирующий ген	Хр5:121021411-121035154 (-)
ЛП/Дж	MGP_LPJ_G0029976	белок, кодирующий ген	Хр5:1277	-127807640 (-)
НОД/ШилтДж	MGP_NODShiLtJ_G0029874	белок, кодирующий ген	Хр5:141017708-141031444 (-)
NZO/HlLtJ	MGP_NZOHlLtJ_G0030544	белок, кодирующий ген	Хр5:125499775-125514342 (-)
PWK/PhJ	MGP_PWKPhJ_G0028890	белок, кодирующий ген	Хр5:120799573-120813398 (-)
СПРЕТ/EiJ	MGP_SPRETEiJ_G0028726	белок, кодирующий ген	Хр5:123178150-1231
WSB/EiJ	MGP_WSBEiJ_G0029251	белок, кодирующий ген	Хр5:126172441-126186184 (-)

Поликлональные антитела DIABLO | Анти-ДИАБЛО

Поликлональное антитело кролика

Хост:	Кролик
Приложения:	ВБ, ВВК
Реактивность:	Человек, Мышь, Крыса
Примечание:	ТОЛЬКО ДЛЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ (RUO).
Краткое описание:	анти-DIABLO подходит для использования в вестерн-блоттинге и иммуногистохимии.

Клональность:	Поликлональный
Сопряжение:	Неконъюгированный
Изотип:	IgG
Состав:	PBS с 0.02% азид натрия, 50% глицерин, рН 7,3.
Очистка:	Аффинная очистка
Диапазон разведения:	WB 1:500-1:2000IHC 1:50-1:200
Инструкция по хранению:	Хранить при -20°C. Избегайте циклов замораживания/оттаивания.

Символ гена:	ДИАБЛО
Код гена:	56616
Юнипрот ID:	ДБЛОХ_ЧЕЛОВЕК
Иммуноген Регион:	1-232
Иммуноген:	Рекомбинантный слитый белок, содержащий последовательность, соответствующую аминокислотам 1-232 человеческого DIABLO (NP_063940.1).

Тканевая специфичность	Повсеместно экспрессируется с максимальной экспрессией в семенниках. Экспрессия также высока в сердце, печени, почках, селезенке, простате и яичниках. Низкий уровень лейкоцитов в головном мозге, легких, тимусе и периферической крови. Изоформа 3 экспрессируется повсеместно.
Посттрансляционные модификации	Убиквитинировано BIRC7/livin.
Функция	Способствует апоптозу путем активации каспаз в пути цитохрома c/Apaf-1/каспазы-9.Действует, противодействуя ингибирующей активности белков-ингибиторов апоптоза (IAP). Ингибирует активность BIRC6/bruce, ингибируя его связывание с каспазами. Изоформа 3 ослабляет стабильность и ингибирующую апоптоз активность XIAP/BIRC4, способствуя убиквитинированию и деградации XIAP/BIRC4 через убиквитин-протеасомный путь. Изоформа 3 также нарушает взаимодействие XIAP/BIRC4 с процессированной каспазой-9 и способствует активации каспазы-3. Изоформа 1 не способна подавлять численность XIAP/BIRC4.
Имя белка	Diablo HomoLog — MitochondRialDirect IAP-связывающий белок с низкой похитительной митохондрийской активатором CASPASESMAC
База данных ссылок	Reactome: R-HSA-111457REACTOME: R-HSA-111463REACTOME: R-HSA-111463Reactome: R-HSA -111464REACTOME: R-HSA-111469REACTOME: R-HSA-111469ReActome: R-HSA-9627069
96278
Сотовая локализация	MitochondriionReated в цитозол, когда клетки подвергаются апоптоз
Альтернативные имена антитела	анти-диабло Связывание белка с антителом Low Pi Анти-антитело против вторичного митохондриального активатора каспазы Антитело против Smac Антитело против DIABLO Антитело против SMAC

Информация получена от Uniprot.орг

12 месяцев на антитела. 6 месяцев для наборов ELISA. Пожалуйста, ознакомьтесь с условиями и положениями веб-сайта для получения дополнительных инструкций.

Smac/DIABLO не высвобождается из митохондрий во время апоптотической передачи сигналов в клетках с дефицитом цитохрома с

Митохондрии играют ключевую роль в апоптозе, вызываемом многими стимулами. Эти сигналы обычно регулируются в митохондриях семейством белков Bcl-2, содержащим как проапоптотические, так и антиапоптотические члены, такие как Bax или сам Bcl-2, соответственно.Здесь мы показали дефекты в митохондриальном апоптотическом сигнальном пути клеток cyt c -/-, которые выходят за рамки возможности блокирования нижестоящей передачи сигналов просто из-за отсутствия cyt c . Несмотря на мобилизацию Bax к митохондриям в клетках, нулевых по cyt c , после обработки STS, эти митохондрии, очевидно, не способны высвобождать Smac/DIABLO. Эти результаты поднимают интересные вопросы о возможном иерархическом порядке высвобождения белков IMS и о роли, которую сам cyt c может играть в пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны, ведущей к высвобождению др. белков IMS.Более того, апоптотические эффекты в клетках cyt c -/- выходят за рамки неспособности активировать апоптосому; вытекающая из этого неспособность высвобождать Smac/DIABLO из митохондрий будет предотвращать ингибирование IAP, которое в противном случае обеспечило бы максимальную активацию каспазы.

Похоже, что апоптотические стимулы способны индуцировать соответствующую передачу сигналов к митохондриям в клетках cyt c -/-. Таким образом, при обработке STS Bax мобилизуется в митохондрии из своего прежнего положения в цитоплазме, а затем активируется.Обычно ожидается, что Bax преодолевает антиапоптотическое ингибирование белками, такими как Bcl-2 и Bcl-x _L , и участвует в пермеабилизации внешней мембраны, приводя к высвобождению cyt c и других белков IMS. В клетках cyt c -/- оказывается, что хотя проапоптотический сигнал Bax принимается, в этом случае он не вызывает высвобождения Smac/DIABLO из митохондрий. Хотя мы определили, что Bax действительно находится в своей активной конформации в митохондриях, мы не исследовали напрямую, происходит ли олигомеризация Bax.Если дефицит cyt c предотвращает образование олигомера Bax, он также может препятствовать образованию каналов Bax на митохондриальной мембране. Хотя эти каналы могут не быть механизмом как таковым для высвобождения cyt c или Smac/DIABLO, образование олигомеров Bax может индуцировать высвобождение cyt c в изолированных митохондриях, ¹⁴ и олигомеризацию Bax, индуцированную tBid во внешней среде. Мембранные везикулы способны индуцировать образование липидных пор, способных высвобождать молекулы до 2000 кДа. ¹⁵

Из предыдущих исследований с использованием Вестерн-блоттинга и конфокальной микроскопии было сделано заключение, что Smac/DIABLO и cyt c высвобождаются в цитозоль более или менее одновременно после апоптотической обработки. ^{3, 4, 16, 17} Таким образом, высвобождение Smac/DIABLO и cyt c , как правило, происходит в одно и то же время по одному и тому же пути. Исследования высвобождения Smac/DIABLO с использованием слитых белков Smac-YFP показывают, что его высвобождение имеет такое же время начала, как высвобождение cyt c , но для высвобождения требуется в три раза больше времени, чем для cyt c . ^{16, 17} Предполагается, что более длительная кинетика высвобождения обусловлена ​​большим размером мономерного Smac/DIABLO (23 кДа) по сравнению с размером cyt c (14 кДа) и существованием Smac/DIABLO в виде дуги. -образный гомодимер, ¹⁸ , который также увеличивает свой размер по сравнению с cyt c. Однако на увеличенную продолжительность высвобождения Smac/DIABLO также может влиять использование флуоресцентных белковых меток. Недавняя работа с клетками 143B, обработанными STS, с использованием иммуноцитохимии для мониторинга кинетики высвобождения cyt c и Smac/DIABLO по отношению друг к другу выявила значительную часть клеток в течение нескольких часов обработки STS, в которых cyt c выпуск произошел, но не Smac/DIABLO (MLR Lim и P Nagley, неопубликованные данные).Таким образом, не только Smac/DIABLO медленнее выходит из митохондрий после того, как высвобождение было инициировано, но инициирование высвобождения Smac/DIABLO может быть значительно задержано по сравнению с cyt c при некоторых обстоятельствах.

В клетках cyt c -/- мы показали, что Smac/DIABLO не мог высвобождаться из митохондрий не только в мягких условиях, которые индуцировали высвобождение в cyt c -позитивных клетках эмбриональных фибробластов мыши, но также и в более энергичных условиях. условия апоптотической стимуляции, такие как более высокие концентрации STS и увеличенное время лечения.Другие индукторы апоптоза, такие как этопозид (рис. 4b), НА14-1 (маломолекулярный ингибитор Bcl-2 ^{19, 20} ) и сывороточное голодание (данные не показаны), также не могли индуцировать высвобождение Smac/DIABLO в ците с. -/-, индуцируя высвобождение как Smac/DIABLO, так и cyt c в cyt c -положительных клеточных линиях.

Было показано, что при некоторых обстоятельствах Smac/DIABLO расщепляется протеасомой после высвобождения в цитозоль, ¹³ , что может быть предотвращено ингибитором протеасомы MG-132.Обработка MG-132 непосредственно в клетках cyt c -/-, по-видимому, вызывала ограниченную степень неспецифической пермеабилизации митохондриальных мембран, что приводило к некоторому высвобождению как Smac/DIABLO, так и белка митохондриального матрикса Hsp60 (рис. 5b). Природа этой пермеабилизации в клетках cyt c -/- дополнительно не исследовалась, за исключением того, что наблюдаемая подвижность полосы Smac/DIABLO соответствует подвижности процессированного белка (после импорта), а не предшественника, размер которого примерно на 5 кДа больше и легко различается по подвижности на SDS-PAGE, как здесь применяется (данные не показаны).Следует подчеркнуть, что количество Smac/DIABLO, высвобождаемого в цитозоль в этих условиях, не увеличивалось при обработке клеток STS. Следовательно, возможное высвобождение Smac/DIABLO из митохондрий и его быстрая деградация протеасомой в цитозоле клеток cyt c -/- исключается как объяснение того, почему мы не смогли обнаружить Smac/DIABLO в цитозоле таких клеток. клеток после обработки апоптотическими реагентами, такими как STS или этопозид.

Отсутствие обнаруживаемого высвобождения Smac/DIABLO в клетках cyt c -/- с множественными апоптотическими стимулами предполагает, что Smac/DIABLO не может высвобождаться независимо от cyt c .Возникает вопрос, связано ли это отсутствие выпуска с тем, что cyt c и Smac/DIABLO высвобождаются с помощью одного и того же механизма, но существует последовательное требование, чтобы выпуск cyt c происходил до выпуска Smac/DIABLO, или находится ли дефект в какой-то сигнальной цепи, включающей митохондрии, которая обычно инициируется cyt c после его высвобождения в цитозоль.

Зависимость высвобождения Smac/DIABLO от cyt c может быть механистической, где cyt c требуется либо непосредственно, либо в качестве кофактора для активации механизма высвобождения Smac/DIABLO.Это может быть «внутренней» реорганизацией митохондрий, посредством чего мобилизация cyt c из областей глубоко внутри крист в IMS и через внешнюю мембрану делает возможным или способствует высвобождению Smac/DIABLO. Было показано, что tBid способствует реорганизации митохондриальных крист, мобилизуя cyt c и делая его доступным для высвобождения. ²¹ Эта критическая реорганизация может также потребоваться для выпуска Smac/DIABLO. Выяснение того, высвобождаются ли cyt c и Smac/DIABLO с помощью одного и того же механизма, может решить вопрос о возможности механистической взаимозависимости; если механизмы высвобождения различны, это может подразумевать роль cyt c в содействии образованию пор в ОМ для высвобождения др. белков IMS.

Альтернативно, зависимость высвобождения Smac/DIABLO от цитохрома c может возникать из-за какого-то внешнего по отношению к митохондриям сигнального механизма. Таким образом, сигнал может быть инициирован cyt c после высвобождения в цитозоль, создавая механизм прямой связи, который делает возможным высвобождение Smac/DIABLO. Сообщалось о системах прямой связи или усиления сигнала для индуцированного митохондриями апоптоза, например, передача сигналов Ca ²⁺ из ER. ²² В этой модели прямой связи апоптотические стимулы способствуют высвобождению небольших количеств цитоцитов c , которые перемещаются в ER, вызывая высвобождение Ca ²⁺ в цитозоль. ²² Предполагается, что высвобожденный Ca ²⁺ активирует митохондрии, вызывая обширную пермеабилизацию внешней мембраны и высвобождение оставшихся цитоцитов c . ²² Высвобождение Smac/DIABLO с помощью этого механизма в этих исследованиях не изучалось, но если происходит общая пермеабилизация ОМ, как это предполагается при митохондриальной перегрузке Ca ²⁺ , ²³ высвобождение Smac/DIABLO, безусловно, будет ожидаемый.

Такую цепь прямой связи следует отличать от цепи, включающей активацию нижестоящих каспаз, которая, как сообщается, необходима для высвобождения AIF. ²⁴ Поскольку активация каспазы-3 невелика или отсутствует в клетках cyt c -/- ⁶ (и рис. 2c), можно ожидать, что высвобождение AIF будет замедленным. Действительно, мы не смогли обнаружить обнаруживаемого высвобождения AIF в клетках cyt c -/- после обработки STS (TM Hansen, неопубликованные данные), а высвобождение AIF из митохондрий не наблюдалось в клетках рака толстой кишки, которые имели cyt . экспрессия c снижена за счет РНК i . ²⁵ Таким образом, эти результаты показывают, что cyt c играет роль в опосредовании или передаче сигналов о высвобождении других апоптогенных белков из IMS во время апоптоза.

Клетки cyt c -/- претерпевают морфологические изменения после обработки STS, такие как сморщивание клеток и скопление митохондрий вокруг ядра, которые типичны для апоптоза. ¹ Дальнейшая работа также показала, что митохондриальный стресс является следствием апоптотических стимулов в клетках cyt c -/-, так что митохондрии в клетках cyt c -/- теряют свой мембранный потенциал после 24-часовой обработки STS, как и 143B. клетки (TM Hansen, неопубликованные данные), характерные для митохондрий на поздних стадиях апоптоза, после активации каспаз. ²⁶ Необходима дальнейшая работа, чтобы выяснить, как клетки cyt c -/- в норме сохраняют свой мембранный потенциал в условиях нарушения транспорта электронов дыхательным путем, какие сигналы вызывают снижение мембранного потенциала в cyt c -/- клетки с обработкой STS и как это влияет на различные компоненты клетки, которые зависят от митохондриальной функции.

В этой статье мы сосредоточились на роли cyt c в апоптозе, а не в респираторном транспорте электронов, как на возможном объяснении того, почему клетки cyt c -/- не подвергаются апоптозу.Мы не считаем вероятным, что дефицит дыхания влияет на способность клеток погибать путем апоптоза. Это связано с тем, что клетки 143B 206 ρ ⁰ (без митохондриальной ДНК), абсолютно дефицитные по дыханию, способны высвобождать как cyt c ²⁷ , так и Smac/DIABLO (рис. 4e) из митохондрий во время STS- индуцированный апоптоз. Однако может быть некоторое тонкое расхождение респираторного транспорта электронов в клетках cyt c -/-, которое влияет на передачу сигналов апоптоза.

Хотя эмбриональная клеточная линия мыши NIh4T3 представляет собой полезный сравнительный материал в настоящих исследованиях, клетки cyt c -/-, в которых экспрессия cyt c была генетически восстановлена, представляют собой важный контроль в подтверждении того, что наблюдаемые дефекты в cyt Клетки c -/- относятся исключительно к отсутствию cyt c , а не к какому-либо дополнительному дефекту. Однако, в отличие от Li et ​​al., ⁶ , нам до сих пор не удалось достичь значительных уровней трансфекции клеток cyt c -/- с использованием векторов, разработанных для экспрессии cyt c , что позволило бы такие опыты проводить.Тем не менее, Li et ​​al. ⁶ показали, что при восстановлении экспрессии cyt c в клетках-хозяевах cyt c -/- клетки подверглись апоптозу в ответ на УФ-облучение, что указывает на то, что в этих клетках не было другого внутреннего апоптотического сигнального дефекта. Нисходящие механизмы апоптоза все еще функционируют в клетках cyt c -/-, как показано при обработке индукторами апоптоза, действующими через путь рецептора смерти. ⁶ Соответственно, мы также наблюдали активацию каспазы-3 в клетках cyt c -/-, обработанных TNF- α и CHX, как и в случае Li et ​​al. ⁶ Такая активация каспазы-3 не зависит от митохондриальной передачи сигналов апоптоза и, предположительно, происходит через усиленный путь рецептора смерти.