Кустарник пузырь плотник: Пузыреплодник, купить саженцы в питомнике ПДК Южный

Известно, что потеря функции ESCRT в имагинальных дисках дрозофилы вызывает избыточный неопластический рост, вызванный неправильной регуляцией сигнальных путей. Однако его влияние на целостность соединения остается неясным. Чтобы выявить события, ведущие к неоплазии, использовали просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ) на имагинальных дисках крыльев, временно лишенных основного компонента ESCRT-III Shrub.Конкретное требование к Shrub было обнаружено в поддержании целостности соединения перегородки (SJ) путем транспортировки Claudin Megatrachea (Mega) в SJ. В отсутствие функции Shrub Mega теряется из SJ и захватывается эндосомами, покрытыми эндосомальным механизмом извлечения Retromer. Функция ESCRT необходима для апикальной локализации и подвижности ретромер-позитивных везикул-носителей, которые опосредуют биосинтетическую доставку Mega в SJ. Соответственно, потеря функции Retromer нарушает антероградный транспорт нескольких основных компонентов SJ, что указывает на новую физиологическую роль этого древнего эндосомального агента (Pannen, 2020).

Развитие и физиологические функции эпителия зависят от набора клеточных соединений, связывающих клетки в ткани в функциональную единицу. В то время как слипчивые соединения (AJ) на основе E-кадгерина обеспечивают адгезию и механические свойства, формирование парацеллюлярного диффузионного барьера зависит от плотных соединений (TJ). Белки консервативного семейства клаудинов играют ключевую роль в установлении и регуляции проницаемости ЩЖ в межклеточном пространстве путем гомо- и гетерофильных взаимодействий с клаудинами соседних клеток.Членистоногие, такие как Drosophila, не обладают TJ, но имеют функционально схожую структуру в эпителии, происходящем из эктодермы, называемом складчатым перегородчатым соединением (pSJ, далее SJ), характеризующимся белково-плотными перегородками, выстилающими межклеточное пространство на электронных микрофотографиях. Структура и функция SJ дрозофилы зависят от сложного мультибелкового комплекса, содержащего по крайней мере дюжину компонентов. Было показано, что три клаудина, среди которых Megatrachea (Mega), необходимы для формирования SJ и барьерной функции у мух.Помимо клаудинов, некоторые трансмембранные белки (TMP), такие как Neurexin-IV (NrxIV), Neuroglian (Nrg) или ATPα, способствуют образованию стабильного сердцевинного комплекса SJ, который характеризуется низкой подвижностью внутри мембраны. На внутриклеточной стороне соединения цитоплазматические белки, такие как Coracle (Cora), Varicose (Vari) и Discs large (Dlg), связываются с трансмембранными компонентами, способствуя формированию стабильного каркаса в виде забора. В то время как формирование соединений во время эмбриогенеза требует локализованного в SJ цитоплазматического белка Dlg, этот фактор базолатеральной клеточной полярности не является структурной частью комплекса ядра неподвижных соединений.Это объясняет функциональное разделение формирования барьера и апикобазальной полярности, несмотря на тесную связь компонентов Dlg-комплекса с СС. Несмотря на растущие знания о структурном составе SJs, внутриклеточные события, необходимые для сборки и поддержания комплексов SJ, остаются в значительной степени неизвестными. В частности, как пролиферативные ткани, такие как эпителий имагинального диска, поддерживают целостность SJ, точно не установлено (Pannen, 2020).

Недавно было показано, что недавно синтезированные компоненты SJ интегрируются в соединение с апикальной стороны (между AJ и SJ) по типу «конвейерной ленты» (Babatz, 2018; Daniel, 2018). Кроме того, компоненты SJ часто связаны с эндосомальными компартментами, указывая на роль эндосомальной системы в координации транспорта и оборота комплексов SJ. Следовательно, эндоцитоз необходим для концентрации компонентов SJ в области соединения во время эмбриогенеза. Это указывает на то, что прохождение компонентов TMP SJ (или всего белкового комплекса SJ) через эндосомальную систему может быть необходимым для образования SJ, при этом основные механизмы остаются плохо изученными (Pannen, 2020).

Эндосомальная система выполняет множество физиологических функций, жестко регулируя внутриклеточный транспорт ТМР и мембран внутри клетки. После эндоцитоза из плазматической мембраны ТМР попадают в эндосомальную систему, где подвергаются специфической сортировке грузов. Этот процесс обеспечивает отделение белков, предназначенных для деградации, от тех, которые выходят из эндосомальной системы для повторного использования. Два эволюционно консервативных эндосомальных сортировочных механизма, эндосомальный сортировочный комплекс, необходимый для транспорта (ESCRT) и ретромерный комплекс, опосредуют сортировку грузов по пути деградации и рециркуляции, соответственно. Чтобы координировать эти противоположные транспортные активности, эндосомальная система включает высокодинамическую мембранную сеть, управляющую ретромер-зависимой трубчатостью для рециркуляции и ESCRT-опосредованной генерацией внутрипросветных везикул (ILV) для деградации (Pannen, 2020).

Эндоцитозированные белки могут избегать зависимой от ESCRT упаковки в ILV, выходя из созревающей эндосомы (ME) через домены тубулярного извлечения, индуцированные специализированными механизмами рециркуляции, такими как ретромер. Первоначально охарактеризованный как регулятор извлечения грузов из эндосомы в Гольджи у дрожжей, этот эндосомальный агент включает два субкомплекса, которые совместно управляют сортировкой грузов в трубчатых рециклирующих переносчиках.Подобно механизму ESCRT, кластеризация грузов и деформация мембран выполняются отдельными функциональными единицами в рамках ретромерного пути. Распознавание и агрегация грузов на основе мотивов опосредуются локализованным в эндосомах комплексом Vps26:Vps29:Vps35, который был назван комплексом, селективным по отношению к грузам, который считается основным функциональным компонентом ретромера. Поскольку древние CSC не обладают активностью по изгибу мембраны, для рециркуляции образования переносчиков требуется взаимодействие с тубулирующими факторами, такими как белки семейства SNX-BAR (Sorting Nexin-Bin/Amphiphysin/Rvs).Белки, содержащие изогнутый BAR-домен, могут собираться в правильные спиральные оболочки на эндосомах, тем самым индуцируя трубчатость, обращенную к цитоплазме. Согласованное действие CSC в стабильном комплексе с белками SNX-BAR для извлечения эндосомального груза первоначально было охарактеризовано как классический ретромерный путь у дрожжей. Однако у многоклеточных животных функция ретромеров не ограничивается SNX-BAR-зависимыми путями. В частности, кооперации CSC с SNX3 или SNX27 (у обоих отсутствуют BAR-домены) появились как альтернативные пути для эндосомального поиска.Протеомные данные по клеткам млекопитающих предполагают, что поверхностные уровни более 100 TMP зависят от ретромера, и многие из этих белков, по-видимому, взаимодействуют с CSC или SNX27. Недавно Drosophila оказалась бесценной для оценки и подтверждения физиологической значимости некоторых из этих предполагаемых ретромерных грузов in vivo (Pannen, 2020).

Белки-карго в эндосомальной системе, которые не подвергаются рециркуляции, могут попасть на путь деградации, начиная с их сортировки в ILV.Генерация ИЛВ на пограничной мембране МЭ требует канонической функции ESCRT, которую выполняют четыре последовательно действующих комплекса (ESCRT-0, -I, -II, III) и АТФаза Vps4. Убиквитинирование ТМР служит первичным сигналом сортировки деградации, а секвестрация ТМР в ИЛВ является необходимой предпосылкой для полной лизосомной деградации. Некоторые компоненты ESCRT, такие как Vps27/Hrs (ESCRT-0) и Vps23/TSG101 (ESCRT-I), обладают взаимодействующими с убиквитином мотивами, которые позволяют им связывать и кластеризовать убиквитинированные TMP.Следовательно, локальная концентрация убиквитинированного груза комплексами ESCRT устанавливает деградативный субдомен на эндосомальной мембране, который пространственно отделен от поискового субдомена. В то время как комплексы ESCRT-0-II обеспечивают распознавание груза и кластеризацию, мембрано-деформирующая активность, необходимая для отпочковывания и отщепления ILV в просвет эндосомы, зависит от компонентов ESCRT-III, которые полимеризуются в спиральные массивы на эндосомальной мембране. Наиболее распространенным компонентом ESCRT-III являются высококонсервативные дрожжи Snf7/Vps32, кодируемые геном кустарника (shrb) у дрозофилы.В отличие от восходящих компонентов ESCRT, белки ESCRT-III только временно собираются в гетероолигомерный комплекс на эндосомальной мембране. Вследствие активности ESCRT созревающая эндосома накапливает содержащие груз ILV и распознается на электронных микрофотографиях как мультивезикулярное тельце (MVB). Путь ESCRT/MVB заканчивается Vps4-зависимой диссоциацией компонентов ESCRT-III от эндосомальной мембраны. Этот шаг необходим для выпуска зарождающейся ИЛВ и последующих раундов формирования ИЛВ.Потеря функции ESCRT была первоначально изучена в дрожжевых клетках, в которых она привела к появлению аберрантной предвакуолярной эндосомальной органеллы, называемой компартментом класса Е. Эта дефектная эндосомальная структура характеризуется накоплением деградационного груза и неспособностью сливаться с вакуолью/лизосомой (Pannen, 2020).

Физиологическая значимость опосредованного ESCRT деструктивного переноса TMP особенно очевидна в ткани имагинального диска дрозофилы. Здесь потеря функции ESCRT вызывает сильный чрезмерный рост, многослойность, апоптоз и инвазивное поведение ткани; фенотип, связанный с неправильной регуляцией клеточных сигнальных путей, таких как пути Jak/Stat-, Jun-Kinase- и Notch.Следовательно, компоненты ESCRT были классифицированы как гены-супрессоры эндоцитарной неопластической опухоли (nTSG) у дрозофилы. В то время как индукция сверхпролиферации и апоптоза у мутантов nTSG подробно охарактеризована, события, ведущие к потере клеточной полярности и, в конечном счете, к неопластической трансформации ткани, остаются плохо изученными (Pannen, 2020).

В этом исследовании была проанализирована целостность клеточных соединений в эпителии имагинального диска крыла с истощенным ESCRT, чтобы получить представление о начальных событиях, ведущих к неопластической трансформации. Удивительно, но в этом исследовании, предшествующем опухолевому разрастанию, было обнаружено сильное и специфическое снижение плотности SJ. Функции ESCRT и ретромера необходимы для антероградного транспорта компонентов SJ. Путем анализа пути внутриклеточного переноса claudin Megatrachea это исследование показало, что биосинтетическая доставка этого основного компонента SJ зависит от сложного базально-апикального пути трансцитоза, основанного на функциях ESCRT и ретромера (Pannen, 2020).

В то время как было показано, что трансцитоз компонентов SJ происходит во время начального образования SJ у эмбриона, это исследование показало, что этот механизм также постоянно требуется во время поддержания SJs в быстро пролиферирующем эпителии.Данные показывают, что ретромер CSC функционирует ниже ESCRT, чтобы экспортировать Mega из эндосомы. Предполагается новая физиологическая роль ретромера CSC в регуляции мембранных уровней нескольких основных компонентов SJ. Хотя данные свидетельствуют о том, что ретромер не может экспортировать Mega из аберрантных эндосом, индуцированных истощением ESCRT, точный механизм этого еще предстоит определить (Pannen, 2020).

Данные показывают критическую потребность в ESCRT в транспортном пути, который зависит от трансцитоза, опосредованного ретромерами, для доставки вновь синтезированного Mega к его апикальному назначению.Дефекты эндосомального извлечения при инактивации ESCRT ранее были описаны в других системах, таких как клетки дрожжей или млекопитающих, и, таким образом, по-видимому, представляют собой общую черту плейотропного фенотипа с дефицитом ESCRT. У дрожжей извлечение из эндосомы в Гольджи сортирующего рецептора Vps10p и его карго-карбоксипептидазы Y (CPY) зависит от функции ретромера. Мутантные штаммы ESCRT накапливают CPY в компартментах класса E, из которых заблокирован доступ к аппарату Гольджи. Сходным образом, ретромерный грузовой маннозо-6-фосфатный рецептор млекопитающих (M6PR) также не смог рециркулировать из эндосом в Golgi в ​​клетках HeLa, лишенных функции TSG101/ESCRT-I.В этом исследовании предполагается, что генерация компартментов класса Е происходит за счет эндосомальных канальцев. Соответственно, ретромер-ассоциированный тубуляционный фактор SNX1 и его дрожжевой гомолог Vps5p были обнаружены на краях компартментов класса E млекопитающих и дрожжей, соответственно. Вместе с обнаружением накопления CSC в Drosophila class E-подобных компартментах это указывает на то, что ESCRT-дефицитные эндосомы остаются покрытыми ретромерными компонентами, но не могут экспортировать специфический груз. (Паннен, 2020).

Хотя нельзя исключать возможность того, что компоненты ESCRT напрямую взаимодействуют с ретромером для формирования рециркуляционных канальцев (обратите внимание, что SNX-BAR, Snx3 и Snx27 не требуются для мегатранспорта), предпочтение отдается непрямому механизму, связывающему ESCRT и ретромер в этом транспортный путь. Анализ аберрантных эндосомальных компартментов, индуцируемых при истощении Shrub, показал, что они обогащены эндосомальными организаторами, такими как Rab5 и Rab7, которые потенциально могут нарушать ретромер-зависимый экспорт, когда их активность на ограничивающей мембране ничем не ограничена. В то время как роль Rab7 в эндосомальном рекрутировании CSC хорошо установлена, необходимость цикла GDP/GTP Rab7 во время ретромер-зависимой генерации носителей все еще обсуждается. Rab7 и его активирующий GTPase белок (GAP) Tbc1d5 являются партнерами по взаимодействию CSC и могут модулировать его способность извлекать эндосомальный груз. Напр., вмешательство в гидролиз Rab7-GTP путем истощения Tbc1d5 приводило к дефектам в ретромер-зависимом транспорте в клетках HeLa. Поразительно, что в этих условиях груз ретромеров был захвачен в эндосомах, покрытых CSC, параллельно с текущим наблюдением субклеточной локализации Mega при истощении ESCRT.Сходным образом, выявляя взаимодействие между компонентами CSC Vps29, Tbc1d5 и Rab7 в мозге взрослых дрозофил, авторы недавнего исследования сообщили о способности эндосомального Rab7 вмешиваться в функцию ретромерных CSC in vivo (Pannen, 2020).

Хотя точный механизм, вызывающий дисфункцию ретромера в компартментах Drosophila класса E, еще предстоит определить, данные подтверждают растущее количество доказательств того, что ESCRT необходима для множественных путей извлечения эндосом. Следовательно, вероятно, что аспекты плейотропного фенотипа ESCRT у многоклеточных животных происходят из-за дефектного экспорта белков из эндосомальной системы. Напр., у Drosophila дырявый SJ может поддерживать ESCRT-опосредованную неопластическую трансформацию, позволяя диффузию сигнальных молекул внутри ткани имагинального диска (Pannen, 2020).

Это исследование показало, что биосинтетическая доставка Mega зависит от механизма, подобного трансцитозу, от базодистальной до апикальной плазматической мембраны.Этот дальний транспорт требовал последовательного действия эндоцитарных (клатрин, динамин, Rab5) и эндосомальных (ESCRT, ретромер CSC) механизмов. Важно отметить, что обнаружение того, что сверхэкспрессированный HA-Mega не может достичь SJ в отсутствие ретромера и функции ESCRT, согласуется с биосинтетической доставкой Mega, зависящей от эндосомальной функции. Следовательно, хотя нельзя исключить возможность того, что Mega транзиторно проходит аппарат Гольджи после эндоцитоза базодистальной мембраны, предпочтение отдается нетрадиционной модели трансцитоза. Поразительно, хотя ретромер-зависимая эндосомальная рециркуляция широко задокументирована, только одно исследование культуры клеток млекопитающих выявило участие ретромера в трансцитозе из одного мембранного домена в другой. Т.о., доставка SJ Mega в имагинальные диски представляет собой новую физиологическую роль ретромера для изучения этого процесса in vivo. Обнаружение того, что CSC-опосредованный антероградный транспорт Mega не зависит от ретромер-ассоциированных сортирующих нексинов, указывает на то, что этот путь трансцитоза отличается от многих установленных CSC-зависимых путей, и предполагает, что он может требовать неизвестных кофакторов (или не требует эндосомальных канальцев) (Pannen , 2020).

Анализ клонов Vps35 в крыльях куколки или имагинальных дисках ног показал, что в этих тканях часто встречаются клоны, полностью лишенные сердцевинного компонента SJ NrxIV. Точно так же кустовых мутантных клонов в нотуме куколки полностью отсутствовали соединительной АТФα (Роланд Ле Боргн, личное сообщение Pannen, июль 2020 г. ). Это контрастирует с поверхностными уровнями компонентов SJ в крыловых дисках мутантов Vps35, которые постоянно снижались примерно на 50%. Это вызывает гипотезу, что параллельный эндосомальный путь экспорта компонентов SJ может существовать в крыловых дисках, который может частично компенсировать потерю ретромера.Однако это маловероятно, поскольку сверхэкспрессированный HA-Mega не достигает SJ не только при Shrub, но и при истощении Vps26. Следует иметь в виду, что этот эксперимент специально отслеживает доставку вновь синтезированного HA-Mega, в то время как клональный анализ Vps35 оценивает влияние потери функции ретромера на ранее существовавший SJ. Т.о., в клональной ситуации ожидается «прореживание» соединений с последовательными раундами клеточных делений, что может объяснить неполную фенотипическую экспрессивность в клонах Vps35 крыловых дисков.Тем не менее, остается определить, почему в дисках ног и крыльях куколок SJ оказывается более чувствительным к потере CSC. Во время метаморфоза клетки имагинального диска крыла претерпевают резкие морфогенетические изменения с образованием эпителия крыльев куколки, процесс, который, как известно, требует ремоделирования AJ. Поэтому возможно, что аналогично AJ, SJ также может активно ремоделироваться во время формирования куколочного крыла. Это может объяснить сильную потребность в функции ретромера для поддержания целостности SJ в ткани, претерпевающей морфогенетические изменения (Pannen, 2020).

Параллельно результатам, описанным в этой статье, предыдущее исследование показало, что эмбриональное формирование SJ зависит от эндоцитоза и последующего перераспределения компонентов соединения от латеральной мембраны к SJ. Т.о., трансцитоз компонентов SJ является механизмом, который, вероятно, необходим как для начального образования SJ, так и для поддержания целостности SJ в неэмбриональных тканях у Drosophila. Хотя роль ESCRT и ретромерных CSC в начальном формировании SJ не оценивалась, возможно, что они уже необходимы для транспорта компонентов SJ во время эмбриогенеза.Последовательно, мутантных эмбрионов кустарника обнаруживают дефектную функцию эпителиального барьера, предполагая, что они неспособны формировать функциональные SJx (Pannen, 2020).

Причина, по которой техническое обслуживание SJ зависит от такого сложного оборота его компонентов, еще предстоит определить. Было высказано предположение, что компоненты SJ образуют стабильные комплексы до интеграции в соединение. Потенциально существенные посттрансляционные модификации некоторых компонентов SJ, необходимые для комплексообразования, могут происходить исключительно на базодистальной мембране или во время прохождения через эндосомальную систему.Если временная локализация компонентов SJ на базо-дистальной мембране является предпосылкой для эффективного формирования сердцевинного комплекса SJ, то депонирование транскриптов для структурных компонентов, таких как Mega, в базальной цитоплазме может сократить путь, который необходимо пройти отдельным компонентам SJ до образования комплекса SJ на базально-дистальном уровне. мембранный домен. Альтернативно, обнаружение того, что Mega мРНК преимущественно локализуется в базальной цитоплазме, обеспечивает основание для другой гипотезы: широко признано, что апикальные и базолатеральные грузы подвергаются сортировке на основе мотивов, ведущей к секреции в направлении соответствующих мембранных доменов. Базальная субклеточная локализация Mega транскриптов потенциально может отражать дивергенцию апикальной/базолатеральной сортировки на уровне мРНК. Соответственно, базальная трансляция и экзоцитоз Mega (индуцированный предполагаемым базальным/базолатеральным сигналом сортировки) могут приводить к его нацеливанию на базодистальную мембрану, несмотря на тот факт, что SJ располагается апикально в клетках крылового диска. Т.о., трансцитоз может служить адаптацией для перераспределения грузов в предназначенный для них мембранный домен, когда они первоначально секретируются в другой из-за ранних сигналов сортировки.Поскольку столбчатые клетки имагинального диска имеют очень вытянутую форму и обладают стопками Гольджи вдоль всей апикобазальной оси, можно предположить, что определенные стопки Гольджи, расположенные на апикальном и базальном полюсах, специализируются на секреции апикального и базолатерального грузов, соответственно. Хотя это весьма гипотетично, систематический анализ локализации транскриптов для апикальных (например, E-cad) и базолатеральных (например, компонентов SJ) грузов может выявить потенциальное пространственное разделение различных секреторных путей уже на уровне мРНК (Pannen, 2020).

В имагинальных дисках крыльев аналогичный сложный путь трансцитоза (хотя и с апикально-базальным направлением) был описан для сигнальной молекулы Wingless, которая транслируется апикально, временно представлена ​​на апикальной мембране и, наконец, трансцитозируется по направлению к базальной мембране, где она секретируется (Ямазаки, 2016). Т.о., различные пути трансцитоза в эпителии крыловых дисков обеспечивают механизм нацеливания определенных белков на место их действия, особенно когда белок транслируется далеко от своего конечного пункта назначения (Pannen, 2020).

В этом исследовании была раскрыта новая физиологическая функция ретромера в регулировании поверхностных уровней клаудина и других структурных компонентов SJ (например, Nrg, ATPα, Lac, NrxIV, Cont) в нескольких тканях дрозофилы. В настоящее время неизвестно, как компоненты SJ отбираются для этого ретромер-зависимого пути и требует ли он физического взаимодействия с компонентами CSC. Поскольку белки SJ могут пересекать эндосомальную систему комплексно, огромное количество различных компонентов приводит к множеству возможных мест взаимодействия. Важно отметить, что исследование мега-интерактома на основе масс-спектрометрии не обнаружило каких-либо ретромерных компонентов CSC или связанных факторов, но уверенно обнаружило основные компоненты SJ, а также клатрин. В то время как способ взаимодействия белков CSC и SJ еще предстоит определить, данные отражают предположение, что несколько сердцевинных компонентов SJ представляют новые предполагаемые грузы ретромеров у дрозофилы (Pannen, 2020).

Поразительно, но среди белков, пораженных потерей функции ретромера, многие обладают гомологами млекопитающих (например,g., NrxIV/CNTNAP2, ATPα/ATP1A1, Nrg/NRCAM). Это говорит о том, что они могут представлять собой новый набор законсервированных ретромерных грузов. В самом деле, несколько линий доказательств указывают на то, что ESCRT/ретромер-опосредованный транспорт компонентов SJ может быть эволюционно консервативным от Drosophila к млекопитающим. Истощение компонента ESCRT-I TSG101 в эпителиальных клетках млекопитающих привело к снижению трансэпителиальной резистентности (TER), что указывает на дефекты барьерной функции, опосредованной TJ. Кроме того, Claudin-1, важный компонент TJ, постоянно подвергался эндоцитозу и рециркуляции обратно в плазматическую мембрану в нескольких клеточных линиях млекопитающих в процессе, требующем функции ESCRT (Pannen, 2020).

Важно отметить, что механизм снижения рециркуляции и захвата Claudin-1 в убиквитин-позитивных аберрантных эндосомах при вмешательстве в функцию ESCRT оставался неуловимым. Таким образом, неизвестно, как достигается экспорт Claudin-1 из эндосомальной системы в клетки млекопитающих. Обнаружив ESCRT-зависимую функцию ретромера CSC в эндосомальном экспорте claudin у Drosophila, эти данные могут обеспечить объяснение возможно консервативного пути транспорта claudins.В подтверждение этого уровни мембран клаудина-1 и клаудина-4 были значительно снижены в исследовании поверхностного протеома на основе масс-спектрометрии клеток человека, лишенных Vps35. Кроме того, белок TJ Zonula occludens-2 (ZO-2) был сильно обогащен интерактомом Vps26, что свидетельствует о том, что предполагаемая функция ретромера в поддержании TJ в клетках млекопитающих может не ограничиваться клаудинами, подобно результатам, полученным у дрозофилы, представленным в этом исследовании. учиться. Остается определить, проявляется ли физиологическая роль ретромера в поддержании TJ млекопитающих также in vivo.Растущее количество инструментов, таких как мыши с условным нокаутом Vps35, позволит проанализировать эту предположительно консервативную функцию ретромера в системах млекопитающих и выявить любые возможные последствия в развитии и/или заболевании (Pannen, 2020).

Недавняя работа показывает, что дефекты на поздних фазах эндосомального пути, вызванные потерей функции гена-супрессора опухоли , летальные (2) гигантские диски ( lgd ) или функции комплексов ESCRT I-III, приводят к лиганд-независимая активация пути Notch во всех клетках имагинального диска у дрозофилы. lgd кодирует член семейства неохарактеризованных белков, члены которого содержат один домен C2 и четыре повтора домена DM14. Функция домена DM14 неизвестна. В этом исследовании сообщается о подробном структурно-функциональном анализе белка Lgd, который показывает, что домены DM14 необходимы для функции Lgd и действуют дублирующим образом. Более того, этот анализ показывает, что домен DM14 обеспечивает специфическую функцию, тогда как домен C2 необходим для субклеточного расположения Lgd.Было обнаружено, что Lgd напрямую взаимодействует с субъединицей ESCRT-III Shrub через домены DM14. Взаимодействие необходимо для функции Shrub, что указывает на то, что Lgd способствует функции комплекса ESCRT-III. Кроме того, генетические исследования показывают, что активация Notch в мутантных клетках ESCRT и lgd происходит по-разному и что активность Shrub и других компонентов ESCRT необходима для активации Notch в мутантных клетках lgd (Troost, 2012). ).

В этом исследовании представлены результаты подробного структурно-функционального анализа Lgd, члена недавно открытого семейства белков, отличительной чертой которого является наличие четырех тандемных повторов нехарактерного домена DM14. Хотя в недавнем исследовании сообщалось о подобном анализе человеческого Lgd2 в клеточной культуре (Zhao, 2010), это первый всесторонний анализ члена этого неохарактеризованного семейства белков на модели животных. Для анализа была разработана новая система анализа, которая обеспечивала экспрессию конструкций на уровне эндогенного lgd .Это было необходимо, поскольку было обнаружено, что процесс переноса белков очень чувствителен к сверхэкспрессии Lgd. Таким образом, данные, полученные при сверхэкспрессии белков Lgd (например, в культуре клеток), следует интерпретировать с большой осторожностью. Это понятие, вероятно, может быть распространено на др. элементы эндосомального пути, т.к. драматические изменения наблюдаются в морфологии эндосом, если др. эндосомальные белки, такие как FYVE-GFP, Rab5-GFP или Rab7-GFP, экспрессируются с помощью системы Gal4. Более того, это исследование показало, что сверхэкспрессия этих белков подавляет активацию Notch в клетках lgd .Эти находки указывают на то, что сверхэкспрессия эндосомальных белков индуцирует значительные изменения в доставке белков через эндосомальный путь (Troost, 2012).

Это исследование показало, что домены DM14 важны для функции Lgd и что они представляют собой новые модули для прямого взаимодействия с основным членом комплекса ESCRT-III во время переноса белка. Более того, этот анализ показывает, что домены DM14 обеспечивают специфическую функцию Lgd и функционируют избыточным образом.Используя клеточную культуру, Nakamura (2008) предоставил доказательства того, что четвертый домен DM14 Lgd2 особенно важен для его функции в качестве каркасного белка, который необходим для передачи сигналов PDK1/Akt, активируемой EGF. Однако у Drosophila не было обнаружено особой важности четвертого домена DM14. В используемых условиях анализа любая комбинация двух из четырех доменов оказывается достаточной для функции Lgd и может спасти мутантный фенотип lgd (Troost, 2012).

Однако это мнение справедливо только при нормальной концентрации Кустарника.В ситуациях, когда активность Shrub снижена ( кустарник ^4-1 /+), варианты с четырьмя доменами могут обеспечивать большую активность и обеспечивать достаточное взаимодействие для поддержания правильного эндосомального переноса. Это уже наблюдалось у животных, гипоморфных по lgd ( lgd ^d7 / lgd ^Ш595 кустарник ^4-1 ). Другими словами, четыре копии DM14 позволяют организму переносить ситуацию двойной гетерозиготности lgd lgd кустарника .Поскольку почти все Lgd-подобные белки, обнаруженные к настоящему времени, имеют четыре копии, вполне вероятно, что эта способность наделяет членов семейства функциональной устойчивостью, которая является эволюционно выгодной. Спасательные эксперименты на сенсибилизированном фоне lgd + /lgd ^4-1 также предполагают, что второй домен DM14 имеет наибольшее значение для функции Lgd у дрозофилы. Это противоречит результатам экспериментов с клеточными культурами Lgd2 человека (Nakamura, 2008).Однако важно отметить, что большая часть доказательств функции у млекопитающих получена в экспериментах с клеточными культурами, которые часто включают сверхэкспрессию ортологов Lgd на уровнях, намного превышающих эндогенные уровни. Учитывая большие трудности в получении разумных результатов с использованием системы Gal4, эти данные следует интерпретировать с осторожностью (Troost, 2012).

Ранее было показано, что домен C2 Lgd может связываться с некоторыми фосфолипидами, такими как фосфатидилинозитол-3-фосфат, фосфатидилинозитол-4-фосфат и фосфатидилинозитол-5-фосфат, в анализе in vitro (Gallagher, 2006).Кроме того, эксперименты по фракционированию клеток с использованием цитозольных экстрактов животных дикого типа и lgd ⁰⁸ мутантных животных, которые кодируют вариант, лишенный С2-домена, позволяют предположить, что небольшая фракция связана с мембраной С2-зависимым образом. Эти биохимические данные контрастируют с исследованиями под микроскопом, в которых сообщается о цитозольном распределении Lgd без какой-либо очевидной связи с мембранными структурами. В соответствии с этим исследование показало, что меченые варианты Lgd, экспрессируемые на эндогенном уровне, локализованы в цитозоле. Более того, было обнаружено, что конструкт lgd , кодирующий чуть больше домена С2 и практически идентичный фрагменту Lgd, используемому в анализе связывания фосфолипидов in vitro (Gallagher, 2006), располагается в цитозоле подобно Lgd. Расхождение между биохимическими и микроскопическими данными можно объяснить тем, что лишь небольшая часть Lgd (которая не выявляется при окрашивании антителами) связана с мембранами. Однако, зная, что Lgd взаимодействует с Shrub, удивительно, что не было обнаружено очевидной ассоциации Lgd даже при истощении Vps4, хотя в этой ситуации комплекс ESCRT-III заперт на эндосомальной мембране.Можно было бы ожидать, что в этой ситуации должна увеличиться связанная с мембраной фракция Lgd. Таким образом, считается, что Lgd находится внутри цитозоля. Это мнение также подтверждается тем фактом, что варианты Lgd, в которых отсутствует домен C2, могут в значительной степени восстанавливать мутантный фенотип lgd , хотя они продуцируются на гораздо более низком уровне, чем другие протестированные конструкции, и чем эндогенный Lgd (Troost). , 2012).

Для домена C2 были определены три различные функции.Первая функция заключается в том, что она обеспечивает стабильность белка, поскольку было обнаружено, что конструкции, кодирующие варианты без домена С2, дают значительно меньшее количество белка, чем варианты с доменом. Второй функцией является локализация Lgd в цитозоле. Эта функция объясняет несоответствие данных in vivo и биохимических исследований, так как в ядре обнаружены варианты без доменов С2. Причина неправильной локализации вариантов Lgd, в которых отсутствует домен C2, на данный момент неясна.Никакой загадочной последовательности ядерной локализации (NLS) не было обнаружено в Lgd. Таким образом, возможно, что он транспортируется в ядре в комплексе с другим белком, содержащим NLS (Troost, 2012).

Представленные результаты указывают на третью функцию домена C2, поскольку было обнаружено, что LgdδDM14, который не может выполнять какую-либо специфическую функцию в тесте восстановления, может превзойти NESLgdδC2 зависимым от C2 образом и тем самым предотвратить частичное восстановление мутанты lgd . Вероятная возможность заключается в том, что домен C2 опосредует взаимодействие с другими белками, что приводит к концентрации Lgd в месте действия в цитозоле. В соответствии с этой возможностью, недавние сообщения показали, что домены C2 Nedd4L, PKC и PKCe опосредуют белок-белковые взаимодействия. Более того, человеческий Lgd2/CC2D1A, по-видимому, взаимодействует через свой домен C2 с ферментом E2 Ubc13 во время передачи сигналов NF-kappaB (Zhao, 2010). Следовательно, благоприятна возможность того, что домен C2 Lgd опосредует белок-белковые взаимодействия вместо того, чтобы локализовать Lgd на отдельной мембране.Возможно, цитозольное взаимодействие предотвращает миграцию Lgd в ядро ​​(Troost, 2012).

Недавние результаты, полученные в экспериментах с культурами клеток млекопитающих, предполагают, что Lgd1 и Lgd2 человека могут также действовать как репрессоры транскрипции (Hadjighassem, 2009; Ou, 2003). Это исследование показало, что Lgd требует локализации в цитозоле для своей функции. Следовательно, текущие результаты не легко совместимы с функцией фактора транскрипции, как предполагается для Lgd1 и Lgd2 человека, и считается, что регуляторная функция гена для Lgd у дрозофилы маловероятна (Troost, 2012).

В предыдущей работе было установлено, что потеря функции комплексов ESCRT-I-ESCRT-III приводит к неавтономной и автономной пролиферации клеток и активации пути Notch. Кроме того, мутантные клетки теряют свою эпителиальную организацию и в конечном итоге погибают. Хотя потеря функции lgd приводит к активации пути Notch и сверхпролиферации, эти эффекты являются клеточно-автономными, и мутантные клетки не теряют своей полярности и хорошо выживают.Таким образом, фенотипы двух групп перекрываются, но не идентичны. Тем не менее, это исследование обнаружило тесную связь между компонентом ESCRT-III Shrub и Lgd. Оба белка физически взаимодействуют, и это прямое взаимодействие важно in vivo, о чем свидетельствуют сильные генетические взаимодействия, обнаруженные между двумя генами. Важно отметить, что было замечено, что время гибели для гипоморфной аллельной комбинации lgd , которая обычно приводит к формированию фаратных взрослых особей, наступает раньше, чем у нулевых мутантов lgd , если активность кустарника снижается наполовину.Более раннее время гибели предполагает, что функция куста нарушается при потере функции lgd . Таким образом, оказывается, что физическое взаимодействие с Lgd необходимо для правильного функционирования Shrub. Поскольку фенотип потери функции кустарника является более вредным и включает в себя больше аспектов, чем lgd , вполне вероятно, что lgd вносит свой вклад, но не является абсолютно необходимым для функции куста . Либо потеря lgd приводит к потере одного отдельного аспекта функции Shrub, либо снижает его активность выше порогового значения, необходимого для полной функции.Тот факт, что сверхэкспрессия Shrub может спасти фенотип lgd , подтверждает вторую возможность. Недавняя работа предполагает, что Shrub образует длинные гомополимеры на цитозольной поверхности эндосомальной мембраны. Эта полимеризация необходима для абсциссии везикул в просвет созревающей эндосомы (Saksena, 2009). Чтобы полимеризоваться, Shrub должен быть преобразован из закрытой цитозольной формы в открытую. После образования внутрипросветных пузырьков (ILV) Shrub превращается в закрытую форму с помощью Vps4 с потреблением АТФ.Поскольку данные предполагают, что Shrub и Lgd взаимодействуют в цитозоле, возможно, что Lgd каким-то образом помогает подготовить Shrub к следующему раунду полимеризации на эндосомальной мембране (Troost, 2012).

Представленные генетические исследования предполагают антагонистическую связь между Lgd и несколькими компонентами комплексов ESCRT в отношении активации Notch. Это подразумевает, что активация Notch в клетках lgd зависит от функции комплексов ESCRT и, следовательно, указывает на то, что она должна происходить в клетках lgd иначе, чем в клетках с мутациями ESCRT. Результаты предполагают, что потеря функции lgd каким-то образом влияет на активность Shrub, что, в свою очередь, приводит к активации Notch. Важно отметить, что антагонизм между lgd и ESCRT наблюдается только в отношении активации передачи сигналов Notch. Что касается морфологии эндосом, они, по-видимому, действуют синергетически, поскольку снижение функции кустарника наполовину приводит к резкому увеличению эндосом гипоморфных клеток lgd , которые обычно не обнаруживают такого дефекта.Таким образом, результаты показывают сложную взаимосвязь между Lgd и функцией ESCRT, и требуется дальнейшая работа для детального разрешения этой взаимосвязи (Troost, 2012).

Поскольку активация Notch невозможна без высвобождения внутриклеточного домена Notch (NICD) в цитозоль, предполагается, что часть или весь Notch должен каким-то образом оставаться на пограничной мембране эндосомы и не включаться в ILV в LGD кл. Есть три возможности, как это может быть достигнуто: отсутствие формирования РКН; Notch может быть неэффективно включен в ILV; или ILVs могут обратно сливаться с ограничивающей мембраной созревающей эндосомы. Задокументировано обратное слияние в клетках позвоночных. Текущие результаты показывают, что потеря функции lgd приводит к снижению активности Shrub. Следовательно, существует вероятность того, что потеря функции lgd приводит к менее эффективному включению Notch в ILV из-за сниженной активности Shrub (Troost, 2012).

Опухолевой супрессор Летальные (2) гигантские диски (Lgd) является регулятором эндосомального переноса сигнального рецептора Notch, а также других трансмембранных белков у дрозофилы.Потеря его функции приводит к неконтролируемой лиганд-независимой активации сигнального рецептора Notch. В этом исследовании изучались последствия потери функции lgd и требования для активации Notch. Было показано, что активация Notch в клетках lgd не зависит от Kuz и зависит от γ-секретазы. В клетках lgd обнаружен дефект, который задерживает деградацию трансмембранных белков, являющихся резидентами плазматической мембраны. Кроме того, результаты показывают, что активация Notch в клетках lgd происходит в лизосомах. Напротив, этот путь активируется на более ранней фазе у мутантов гена, кодирующего компонент ESCRT-III Shrub, который является партнером взаимодействия Lgd. Далее было показано, что активация Notch, по-видимому, является общим следствием потери функции lgd . Кроме того, при электронной микроскопии клеток lgd обнаружено, что они содержат увеличенные мультивезикулярные тельца.Представленные результаты дополнительно проясняют механизм неконтролируемой активации Notch при нарушении эндоцитоза (Schneider, 2013).

Передача сигналов Notch участвует во многих гомеостатических процессах и процессах развития у всех многоклеточных животных, а неконтролируемая активация является причиной заболеваний у людей. Следовательно, важно разгадать механизмы его нормальной, а также неконтролируемой активации. Предыдущая работа показала, что потеря функции lgd приводит к независимой от лиганда активации пути передачи сигналов Notch в клетках имагинального диска. Эта активация по-прежнему зависела от активности функции Psn , которая кодирует компонент комплекса γ-секретазы. Эта работа расширяет характеристику lgd и более точно определяет условие, при котором Notch активируется в клетках lgd . Более того, было показано, что активация Notch является следствием потери функции lgd также и в другой ткани, эпителии фолликулов. Это предполагает, что это общее следствие потери функции lgd в клетках Drosophila .Было подтверждено, что комплекс γ-секретазы необходим для активации Notch в клетках lgd . Кроме того, представлен первый ЭМ-анализ мутантных клеток lgd , который указывает на то, что часть эндосом клеток lgd действительно увеличена и содержит ILV (Schneider, 2013).

Ранее была предложена модель активации Notch в клетках lgd (Troost, 2012). Некоторые из неопределенностей этой модели разрешены результатами текущей работы.Это исследование показало, что для активации Notch требуется слияние эндосомы с лизосомой. Таким образом, активация, вероятно, происходит в лизосомах, а не в МЭ. Этот вывод имеет несколько следствий. Во-первых, это указывает на то, что дефект возникает во время созревания эндосомы в клетках lgd , поскольку слияние ME с лизосомой не приводит к активации Notch в клетках дикого типа. Во-вторых, это указывает на то, что, хотя клетки lgd дефектны в деградации трансмембранных белков, МЭ в конечном итоге сливаются с лизосомами.Таким образом, деградация задерживается, а не предотвращается. Эта задержка слияния может объяснить наблюдение, что клетки lgd содержат фракцию умеренно увеличенных MVB, потому что это позволяет ME подвергаться более гомотипическим слияниям и, таким образом, со временем расти до большего размера, чем обычно. В-третьих, это указывает на то, что наблюдаемое накопление Notch в МЭ до высоких уровней само по себе не является причиной активации пути. Это представление также подтверждается наблюдением, что, хотя все lgd клеток фолликулярного эпителия активируют Notch-путь, не все демонстрируют сильное накопление Notch в MEs (Schneider, 2013).

Необходимым условием для любой активации Notch является то, что NICD должен быть обращен к цитозолю, чтобы он мог получить доступ к ядру после его высвобождения. Во время нормальной деградации Notch включается в ILV, а NICD отделяется от цитозоля. Таким образом, он не может получить доступ к ядру, даже если произойдет расщепление. Это соображение подразумевает, что в клетках lgd образование ILVs должно либо отказывать, либо Notch неэффективно встраивается в них. ЭМ-анализ показал, что увеличенные МЭ содержали ИЛВ.Таким образом, оказывается, что на формирование ILV, по крайней мере, не сильно влияет потеря lgd . Недавно было показано, что Lgd физически взаимодействует с Shrub и необходим для его полноценного функционирования (Troost, 2012). О подобном взаимодействии сообщалось между ортологами Lgd Interact у млекопитающих и ортологами Shrub, CHMP4a, b, c (Martinelli, 2012; Usami, 2012). Более того, экспериментов in vitro предполагают, что Lgd1 и Lgd2 могут влиять на полимеризацию белков CHMP (Martinelli, 2012). Следовательно, существует вероятность того, что при потере функции lgd Notch неэффективно включается в ILV из-за снижения, но не отмены активности кустарника . Следовательно, часть или весь Notch не включается в ILV и остается в пограничной мембране ME (фракция NLM). Эта фракция NLM затем активируется независимым от лиганда способом. Однако создание фракции NLM является необходимым условием для активации Notch в клетках lgd , но этого недостаточно.Потеря функции часов предотвращает активацию Notch в клетках lgd . У ч. мутантов подавляется образование ИЛВ и в результате в ЛМ остается груз (Нотч). (Шнайдер, 2013).

Текущие результаты предоставляют больше информации о дальнейших требованиях активации Notch в ячейках lgd . Активация Notch не зависит не только от лигандов, но и от куз . Kuz необходим для сброса эктодоменов, что является предпосылкой для RIP комплексом γ-secretase.Поскольку активность γ-секретазного комплекса необходима для активации Notch в клетках lgd , отщепление эктодомена Notch должно происходить альтернативным образом в клетках lgd . Альтернативный шеддинг эктодоменов фракции NLM в лизосомах можно легко объяснить деградацией NECD, которая распространяется в просвет под действием активированных кислых гидролаз. Таким образом, может быть получен NEXT-подобный фрагмент, который служит субстратом для комплекса γ-secretase.Было показано, что комплекс γ-secretase активен в лизосомах и, вероятно, он может выполнять RIP на NEXT-подобном фрагменте для высвобождения NICD в цитозоль. С этим сценарием согласуется открытие, что N ^δEGF активируется в lgd , но не в клетках дикого типа. Это свидетельствует о том, что оставшиеся повторы lin12 N ^δEGF , выступающие в просвет, изменяют свою конформацию или деградируют в клетках lgd . Активация Notch в клетках lgd требует функции активности вАТФазы.Этот протонный насос необходим для закисления просвета МЭ, что, в свою очередь, является предпосылкой для активации кислых гидролаз в лизосомах. Функция vATPase во время активации пути Notch в клетках lgd может быть двоякой: ее активность является предпосылкой для активации гидролаз. Кроме того, возникающее в результате подкисление просвета может также денатурировать NECD или даже устранить солевые мостики Ca ²⁺ между NICD и NECD. Стоит отметить, что функция вАТФазы при активации Notch в клетках lgd отличается от таковой при лиганд-зависимой активации.Эта активация, по-видимому, происходит в ЭЭ, люминальный рН которого значительно выше. Однако данные предполагают, что расщепление S1 необходимо дополнительно. Таким образом, вероятно, взаимодействие нескольких факторов вызывает активацию Notch (Schneider, 2013).

Результаты уточняют ранее предложенную модель активации Notch в клетках lgd . Это предполагает, что потеря функции lgd приводит к снижению активности Shrub.Как следствие, часть или весь Notch остается на пограничной мембране ME. При слиянии с лизосомой активированные гидролазы, возможно, в сочетании с кислой средой вызывают альтернативный сброс эктодомена. Это создает NEXT-подобный субстрат для комплекса γ-secretase, который высвобождает NICD в цитозоль (Schneider, 2013).

Модель очень похожа на модель, предложенную для регуляции активации Notch с помощью E3-лигазы Deltex.Недавняя работа сообщает о близком функциональном родстве между ререстиноподобным белком Kurtz (Krz), Deltex (Dx) и Shrub при регуляции Notch (Hori, 2011). Авторы предложили модель, в которой Shrub подавляет активность Notch путем включения полиубиквитинированного рецептора в ILV, в то время как Dx препятствует этому включению и способствует активации. Dx выполняет свою функцию, регулируя статус убиквитинирования NICD. Его сверхэкспрессия смещает равновесие от поли- к моно-убиквитилированию.Будет интересно определить, как Lgd вписывается в эту схему. Качественно фенотип потери функции lgd подобен фенотипу сверхэкспрессии Dx, хотя уровень активации Notch сильнее. Это предполагает, что Lgd противодействует функции Dx. Модель, предложенная Hori (2011), предполагает, что Dx препятствует включению Shrub Notch в ILV. Lgd, по-видимому, влияет на активность Shrub посредством прямого физического взаимодействия (Troost, 2012). Таким образом, поддерживается возможность того, что связь между Dx и Lgd является косвенной и опосредованной через Shrub (Schneider, 2013).

Эксперименты показывают, что для активации Notch в клетках lgd требуется процесс с ограниченной емкостью. Возможно, что пораженный процесс представляет собой расщепление Notch комплексом γ-секретазы, поскольку было обнаружено, что эктопическая активация Notch в клетках lgd подавляется за счет снижения активности комплекса. Если это так, то необходимо объяснить, как другие трансмембранные белки, которые могут конкурировать с Notch, превращаются в субстраты для комплекса γ-secretase.Возможно, что они также подвергаются альтернативному сбросу эктодоменов (Schneider, 2013).

Это исследование подтвердило, что потеря функции куста приводит к активации пути Notch также во время оогенеза. Дополнительным подтверждением является сделанный ранее вывод о том, что активация Notch в клетках куста происходит по другому механизму, чем в случае lgd , поскольку было обнаружено, что активация Notch подавляется, если Rab7 истощен в lgd. , но не куста клеток (Troost, 2012).Это открытие указывает на то, что активация в клетках кустарника происходит в МЭ, а не в лизосомах. Т.о., активация Notch может происходить в нескольких эндосомальных компартментах (Schneider, 2013).

Возможно, разные уровни инактивации куста вызывают разные режимы активации Notch. Потеря функции куста приводит к сильной активации Notch и потере целостности эпителия (Hori, 2011; Troost, 2012).Однако небольшое снижение функции кустарника лишь слабо активирует Notch и, по-видимому, мало влияет на целостность эпителия (Hori, 2011). Это повышает вероятность того, что активация Notch за счет снижения активности куста может происходить по другому механизму, чем при устранении функции куста . Было бы интересно исследовать, происходит ли легкая активация Notch в лизосомах или эндосомах (Schneider, 2013).

Путь передачи сигналов Notch определяет консервативный механизм, который регулирует выбор клеточной судьбы у многоклеточных животных. Передача сигналов модулируется широкой и многогранной генетической схемой, включая элементы эндоцитарного аппарата. Несколько отдельных стадий эндоцитарного пути связаны с положительной или отрицательной регуляцией рецептора Notch. При поиске генетических элементов, участвующих в регуляции эндосомной/лизосомной деградации Notch, опосредованной молекулярной синергией между убиквитинлигазой Deltex и Kurtz, невизуальным бета-аррестином дрозофилы, в этом исследовании был идентифицирован Shrub, основной компонент комплекса ESCRT-III. как ключевой модулятор этой синергии.Shrub способствует лизосомальной деградации рецептора, опосредуя его доставку в мультивезикулярные тельца (MVB). Однако взаимодействие между Deltex, Kurtz и Shrub может обойти этот путь, приводя к активации рецептора. Этот анализ показывает, что Shrub играет ключевую скорость-лимитирующую стадию в поздней эндосомальной лиганд-независимой активации Notch, в зависимости от Deltex-зависимого состояния убиквитинилирования рецептора. Этот способ активации рецептора подчеркивает сложность модуляции сигнала Notch в клетке и имеет важное значение как для развития, так и для заболевания (Hori, 2011).

Чрезвычайная чувствительность нормального развития к дозе рецептора Notch проявляется в гаплонедостаточном и трипломутантном поведении локуса Notch . Чувствительность к дозировке согласуется с тем фактом, что механизм передачи сигналов Notch опирается на стехиометрические взаимодействия, а не на этапы ферментативной амплификации для передачи сигнала от поверхности к ядру. Это также обеспечивает обоснование наблюдения, что клеточные события, участвующие в перемещении/обмене, появляются в качестве основных механизмов, контролирующих сигналы Notch.Канонический путь основан на активации рецептора, запускаемой его взаимодействием с лигандами, связанными с мембраной, на соприкасающейся клетке, но возможность того, что рецептор может также активироваться внутриклеточно, лиганд-независимым образом, как показали несколько исследований, включая настоящее , предполагают, имеет важное значение для биологии и патобиологии Notch. Правила, управляющие тем, как и где рецептор, проходящий через эндоцитарные компартменты, может активироваться в присутствии или в отсутствие лиганда, до сих пор полностью не определены.Более того, неясно, как такие события интегрируются в генетические схемы, которые влияют на регуляцию сборки и функции эндосомального компартмента (Hori, 2011).

Это исследование дает представление об этих вопросах, показывая, что взаимодействие между модулятором сигнала Notch Dx, невизуальным ортологом β-аррестина Krz и критическим компонентом комплекса ESCRT-III, Shrub, направляет Notch либо к деградации, либо к лиганд-независимый путь активации, параллельный различным состояниям убиквитинилирования Notch.Путь ESCRT, недавно описанный как «машина распознавания грузов и создания мембран», определяет сложный, многоцелевой клеточный механизм с клеточными ролями и молекулярными механизмами, которые полностью не выяснены (Henne, 2011). ESCRT имеет решающее значение для обеспечения различных стадий, ведущих к сортировке мембранных белков в MVB на их пути к лизосомной деградации. Причастность Shrub к процессам, связанным с передачей сигналов Notch, была выявлена ​​посредством беспристрастного генетического скрининга изогенных модификаторов dx-krz-зависимого фенотипа, который основан на эндосомальной/лизосомной деградации рецептора Notch.Это исследование не первое, в котором установлена ​​общая связь между передачей сигналов Notch и механизмом ESCRT, но как генетический скрининг, так и последующий анализ указывают на дифференциальную и основную роль комплекса ESCRT-III в dx-krz-зависимом , лиганд-независимый способ передачи сигналов Notch описан в этом исследовании (Hori, 2011).

Несколько исследований установили, что когда рецептор Notch входит в эндоцитоз, он может активироваться внутри клетки как лиганд-зависимым, так и лиганд-независимым образом.Следовательно, было показано, что некоторые элементы эндосомального аппарата, включая элементы комплексов ESCRT, влияют на внутриклеточное накопление и активацию рецептора Notch. Текущие данные совместимы с этими исследованиями и действительно расширяют и дополняют их. Эти исследования нельзя сравнивать напрямую не только из-за разного генетического фона, что является решающим элементом в оценке генетических взаимодействий, но и потому, что в этом исследовании анализируется влияние функции ESCRT на модуляцию передачи сигналов Notch посредством синергетического действия Dx и Krz. которые вполне могут определить другой, но специфический путь.Принимая во внимание всю совокупность работ, связанных с различными аспектами переноса рецепторов Notch, кажется, что может быть несколько различных способов, которыми рецептор может активироваться после вступления в эндоцитозный путь. Некоторые исследования связывают ранние эндосомы с активацией рецептора, тогда как др. связывают поздние эндосомальные компартменты с лиганд-независимой активацией Notch. Особое отношение к способу активации, задокументированному в этом исследовании, имеют генетические исследования Wilkin (2008), которые связали активацию Notch с комплексами HOPS (гомотипическое слияние и сортировка белков вакуолей) и AP-3 (адапторный белок-3), демонстрируя существование Путь активации Notch, который зависит от поздних эндосомальных компартментов (Hori, 2011).

Это исследование показало, что экспрессия Shrub вызывает резкий субклеточный сдвиг рецептора Notch к MVB, что согласуется с тем фактом, что ESCRT-III опосредует деубиквитинирование груза, отпочкование и расщепление внутрипросветных везикул, которые контролируют доставку груз к лизосомам. Понижающая регуляция сигналов Notch с помощью Shrub, по-видимому, связана с рекрутированием Notch во внутрипросветные пузырьки и его возможной деградацией. С другой стороны, нарушение клеточного равновесия между Dx и Shrub путем подавления Shrub и/или повышения Dx активирует рецептор лиганд-независимым образом.Также ясно, что способ активации Notch в этом исследовании не зависит от лигандов и связан со статусом убиквитинилирования рецептора Notch, который, в свою очередь, модулируется Dx и Krz. Было показано, что Krz модулирует активность Notch благодаря своей способности регулировать уровни белка Notch. С интересом отмечено, что, хотя β-аррестины участвуют в качестве адапторов во время клатрин-зависимого эндоцитоза, Ram8, гомологичный аррестину белок дрожжей, также был связан с привлечением механизма ESCRT к MVB, нагруженным G-связанным рецептором. груз.Если Krz имеет аналогичную связь с механизмом ESCRT, он может быть вовлечен в сортировку Notch на MVB ​​и, следовательно, в возможное привлечение Notch во внутрипросветные везикулы для деградации, представление, совместимое с наблюдением, что Krz усиливает зависимое от Shrub подавление Нотч (Хори, 2011).

Чтобы рецептор проник во внутрипросветные пузырьки, должно произойти деубиквитинилирование груза. Примечательно, что Snf7 (ортолог Shrub у дрожжей) рекрутирует деубиквитинирующий фермент Doa4, необходимый для такого деубиквитинирования груза.В исследованиях клеточных культур, где четко прослеживалась относительная субклеточная локализация Notch, Shrub и Dx, наблюдалась локализация Notch, Shrub и Dx с мембранами MVB. Поскольку этот субклеточный фенотип сопровождается резкой лиганд-независимой активацией рецептора и переходом от поли- к моно-убиквитиновому статусу рецептора, это приводит к предположению, что Dx, который физически взаимодействует с Notch, вмешивается в процессы, которые необходимы для загрузки рецептора на внутрипросветные везикулы (Hori, 2011).

Понятно, что для решения многих вопросов, поднятых в настоящем исследовании, необходим более подробный анализ субклеточной динамики in vivo. На основе данных, представленных в этом исследовании, представлена ​​модель для обнаруженного режима активации. Предполагается, что компонент ESCRT-III Shrub может регулировать цикличность рецепторов, направляя их на сигнальный путь, судьбу, модулируемую Dx и Krz. Т.о., передача сигналов Notch может быть ослаблена внутри клетки лиганд-независимым образом.Остается определить, как такая внутриклеточная передача сигналов служит логике развития Notch, которая связывает судьбу одной клетки с судьбой соседней клетки. Такой способ действия Notch может оказаться полезным для модулирования судьбы клетки, которая, например, циркулирует и, таким образом, не обязательно находится в контакте с экспрессирующим лиганд соседом. Независимо от потенциальной роли независимой от лиганда активации в нормальном развитии, активация рецептора может иметь глубокие патологические последствия. Следовательно, понимание путей, способных модулировать активность Notch внутриклеточным лиганд-независимым образом, имеет большое значение (Hori, 2011).

Ген-супрессор опухоли летальные (2) гигантские диски ( lgd ) участвует в эндосомальном переносе трансмембранных белков у дрозофилы .Потеря функции приводит к независимой от лиганда активации пути Notch во всех клетках имагинального диска и фолликулярных клетках. Анализ потери функции lgd в значительной степени был ограничен имагинальными дисками и предполагает, что никакие другие сигнальные пути не затронуты. Преданность Lgd пути Notch вызывает недоумение, учитывая, что потеря функции lgd также влияет на перенос компонентов других сигнальных путей, таких как путь Dpp ( Drosophila BMP).Более того, Lgd физически взаимодействует с Shrub, фундаментальным компонентом механизма переноса ESCRT, потеря функции которого приводит к активации нескольких сигнальных путей. Это исследование показывает, что во время оогенеза потеря функции lgd вызывает эктопическую активацию сигнального пути Drosophila BMP. Эта активация происходит в соматических фолликулярных клетках, а также в клетках зародышевой линии. Активация клеток зародышевой линии вызывает дополнительный цикл деления, в результате чего образуются яйцевые камеры с 32 клетками вместо 16.Кроме того, было сформировано больше зародышевых стволовых клеток. Мутантные клетки lgd дефектны в переносе через эндосомы, вызывая накопление рецептора Dpp I типа Thickveins в созревающих эндосомах, что, вероятно, вызывает активацию этого пути. В совокупности эти результаты показывают, что потеря функции lgd вызывает различные эффекты в тканях и может приводить к активации сигнальных путей, отличных от Notch. Далее они показывают, что эндосомальный путь играет роль во время оогенеза (Morawa, 2015).

В последние годы было установлено, что ген супрессора опухолей летальные (2) гигантские диски ( lgd ) [ l(2)gd1 — FlyBase] играет роль в эндосомальном пути и в регуляции активность пути Notch у Drosophila melanogaster . Потеря его функции приводит к дефекту эндосомального переноса трансмембранных белков, которые накапливаются при созревании. эндосомы (МЭ). Этот дефект вызывает конститутивную активацию пути Notch лиганд-независимым образом. lgd кодирует член эволюционно консервативного семейства, члены которого содержат четыре повтора нового домена DM14, за которыми следует один домен C2. Мутация в одном из двух человеческих ортологов, LGD2 (также называемом Aki, Freud-1, TAPE и Cc2d1a), вызывает умственную отсталость, и этот белок может быть супрессором опухоли в клетках печени (Morawa, 2015).

У Drosophila рецептор Notch активируется двумя лигандами, Delta (Dl) и Serrate (Ser). Их связывание инициирует S2-расщепление внеклеточного домена Notch (NECD).Затем расщепленный NECD подвергается трансэндоцитозу вместе с лигандом в посылающей сигнал клетке. Расщепление осуществляется металлопротеиназой, кодируемой kuzbanian ( kuz ) в Drosophila . Полученный фрагмент промежуточного внеклеточного усечения Notch (NEXT) расщепляется комплексом γ-секретазы, который содержит Aph-1 и пресенилин (Psn). Это S3-расщепление высвобождает внутриклеточный домен Notch (NICD) в цитозоль, откуда он мигрирует в ядро, чтобы активировать гены-мишени вместе с Suppressor of Hairless [Su(H)].Предыдущая работа показала, что конститутивная активация Notch, наблюдаемая в мутантных клетках lgd , требует активности комплекса γ-secretase (Morawa, 2015).

Notch конститутивно проходит через эндосомальный путь для деградации в лизосоме. Торговля инициируется эндоцитозом, что приводит к образованию ранних эндосомальных пузырьков. Эти везикулы сливаются, образуя раннюю эндосому (EE). Рецепторы, предназначенные для деградации, остаются в МЭ, которые в конечном итоге сливаются с лизосомами, где происходит деградация груза.При созревании эндосомы рецепторы концентрируются в доменах ее пограничной мембраны (ПМ) и транслоцируются в просвет МЭ путем отщипывания этой части в виде внутрипросветных везикул (ВПВ). Формированием ИЛВ достигается отделение НИКД рецепторов от цитозоля. Этот шаг важен для полной деградации рецепторов, а также прекращения передачи сигналов через активированные рецепторы (Morawa, 2015).

События в эндосомальном пути контролируются малыми GTPases, в основном Rab5 и Rab7 (Huotari, 2011).Rab5 управляет событиями в EE, такими как инициация образования ILV посредством рекрутирования эндосомальных сортирующих комплексов, необходимых для транспорта (ESCRT)-0, первого из пяти последовательно действующих комплексов, называемых ESCRT-0-ESCRT-III и Vps4 (обзор Херли, 2010). ESCRT-0 инициирует последовательное привлечение комплексов и концентрирует убиквитилированные рецепторы в местах образования ВЛЖ. ESCRT-0 состоит из Hrs и Stam. Центральный компонент последнего действующего комплекса ESCRT-III у дрозофилы кодируется кустарником .Он кодирует ортолог Drosophila белков семейства CHMP4 млекопитающих и Snf7 дрожжей. Кустарник рекрутируется в ЛМ МЭ, где полимеризуется. в филаменты для выполнения отщепления ИЛВ совместно с комплексом Vps4. В результате действия ЭСКРТ комплексов, МЭ содержит все большее количество ИЛВ и называется мультивезикулярным тельцем (МВТ). В недавней статье приводятся доказательства того, что LGD2 также взаимодействует с CHMP4 во время почкования ВИЧ.Хотя потеря функции ESCRT-I, -II и -III приводит к активации Notch и других сигнальных путей. путей у Drosophila , у ESCRT-0 нет. Объяснение этому загадочному факту состоит в том, что ESCRT-0 выполняет дополнительную функцию, необходимую для активации в Мутанты ESCRT-I, -II и -III. Это может заключаться в скоплении груза в местах формирования РКН. Дополнительная функция ESCRT-0 также необходима для активации пути Notch в мутантных клетках lgd , поскольку одновременная потеря активности ESCRT-0 и Lgd подавляет активацию Notch (Morawa, 2015).

Было показано, что Lgd физически взаимодействует с основным компонентом ESCRT-III Shrub (Troost, 2012). Это взаимодействие важно для полной активности Shrub in vivo . Генетические эксперименты показали, что активация Notch в мутантных клетках lgd требует Rab7-опосредованного слияния ME с лизосомой (Schneider, 2013). Более того, любая др. манипуляция, которая предотвращает слияние ME с лизосомой, такая как потеря функции Rab7, подавляет активацию Notch в мутантных клетках lgd (Schneider, 2013).Эта потребность в слиянии объясняет парадокс в отношениях между Lgd и Shrub: активация Notch в мутантных дисках lgd подавляется, если активность кустарника снижается до 50%, хотя их индивидуальная потеря приводит к активации Notch (Troost , 2012). Парадокс может быть объяснен наблюдением, что MEs этих клеток теряют ассоциацию с Rab7 и не сливаются с лизосомой (Schneider, 2013). Т.о., активация пути Notch не удается, потому что эндосомы более дисфункциональны, чем в мутантных клетках lgd (Morawa, 2015).

У Drosophila потеря функции ESCRT-I, -II и -III в имагинальных дисках приводит к эктопической активации пути Notch. Кроме того, усиливается активность пути Drosophila BMP, называемого путем Decapentaplegic (Dpp). Кроме того, потеря функции ESCRT вызывает потерю целостности эпителия. Однако предыдущий анализ имагинальных дисков показывает, что ни на активность др. основных сигнальных путей, таких как путь Dpp, ни на целостность эпителия не влияет потеря функции lgd (Schneider, 2013).Следовательно, фенотип мутантов ESCRT более тяжелый, чем фенотип мутантов lgd с потерей функции, несмотря на их близкие отношения (Morawa, 2015).

Анализ сигнальных путей у мутантов lgd , описанных выше, был ограничен имагинальными дисками и показал, что затронут только путь Notch. Неизвестно, затронуты ли эти пути в других мутантных тканях. Развитие ооцита дрозофилы представляет собой превосходную систему для изучения клеточных процессов, таких как клеточная передача сигналов, и, таким образом, для ответа на этот вопрос.Во время оогенеза потомство стволовой клетки зародышевой линии (GSC) развивается через определенные и узнаваемые стадии в зрелую яйцеклетку в овариоле. Овариола подразделяется на передний гермарий, который содержит два вида стволовых клеток, и заднюю часть, состоящую из цепочки все более старых яйцевых камер (ECs) с 16 клетками зародышевой линии (GCs), окруженными соматическим фолликулярным эпителием. ЭК отпочковываются от гермария и созревают при их задней миграции. ГСК располагаются на переднем конце гермария и окружены клетками соматической шапочки, образующими нишу, необходимую для их выживания.То ниша может вместить 2-3 ГСК. Они делятся асимметрично, давая начало другому GSC и цистобласту, который начинает дифференцироваться. Цистобласт подвергается четырем раундам митотических делений, в результате чего образуется киста с 16 GCs. Киста инкапсулируется соматическими фолликулярными клетками (ФК) для образования ЭК. ФК генерируются двумя соматическими стволовыми клетками, расположенными на выходе из гермария. Один GC в каждом EC дифференцируется в ооцит, тогда как остальные 15 дифференцируются в полиплоидные питающие клетки (Morawa, 2015).

Для поддержания популяции GSC требуется несколько сигналов. Они испускаются на кончике гермария колпачковыми клетками. Наиболее важным из них является Dpp. Хотя клетки передней крышки, вероятно, ответственны за большую часть сигнала Dpp, степень его домена экспрессии остается неясной. Dpp активирует корецепторы Thickveins (Tkv; тип 1) и рецепторы типа 2 на GSC. Результатом передачи сигналов Dpp является подавление экспрессии мешка шариков ( bam ) в GSC.Когда GSC делится, дочерняя клетка, прикрепленная к кэп-клетке, получает сигнал Dpp, который подавляет экспрессию bam и поддерживает судьбу GSC. Неконтактирующая дочерняя клетка не получает достаточного сигнала и продуцирует Bam, что вызывает ее дифференцировку в цистобласт. Т.о., сайленсинг Bam является отличительной чертой асимметрии женской зародышевой линии Drosophila . Короткий диапазон сигнала Dpp достигается за счет деградации активированного рецептора Tkv в цистобласте с помощью специфического механизма, который включает киназу Fused (Fu) и лигазу E3 Smurf. Если механизм нарушается, например, при инактивации fu , количество ГСК увеличивается и происходит дополнительный раунд деления клеток кисты, часто дающий ЭК с 32 вместо 16 ГЦ (Morawa, 2015).

Одним хорошо охарактеризованным событием во время оогенеза, опосредованным через сигнальный путь Notch, является переключение с митотического цикла на эндоцикл в FCs ECs, которое происходит между стадиями 6 и 7. Это переключение запускается сигналом Dl от GCs и инициирует дифференцировку FC посредством активации экспрессии Hindsight (Hnt).Ранее было показано, что потеря функции lgd в FC приводит к преждевременной активации пути Notch и экспрессии Hnt (Schneider, 2013). Как и в крыловых дисках, активация не зависит от Kuz и зависит от Hrs и слияния МЭ с лизосомой (Schneider, 2013). Следовательно, активация вызывается тем же механизмом, что и в крыловом диске (Morawa, 2015).

Последствия потери функции lgd в зародышевой линии были исследованы ранее с использованием аллеля lgd ^d3 . EC наблюдались более чем с 40 GCs, что характерно для мутантов-супрессоров опухолей. Однако анализу мешала неопределенная природа lgd ^d3 и отсутствие соответствующих маркеров (Morawa, 2015).

В этом исследовании дополнительно изучалась функция lgd во время оогенеза. Его потеря вызывает активацию пути Dpp в дополнение к пути Notch в FC. В зародышевой линии потеря функции lgd вызывает внемитотическое деление, в результате которого образуются ЭК с 32 GC.Кроме того, это вызывает образование большего количества ГСК. Оба фенотипа зависят от эктопической активации Dpp. Эти результаты показывают, что эти фенотипы вызваны неспособностью разлагать Tkv. Более того, было обнаружено, что потеря функции кустарника приводит к сходному фенотипу (Morawa, 2015).

Ранее проведенный анализ функции lgd в основном ограничивался имагинальными дисками. Предполагается, что потеря функции lgd специфически активирует путь Notch. Более того, потеря функции lgd в FC приводит к активации пути Notch таким же образом, как и в клетках имагинального диска. Преданность Lgd пути Notch вызывает недоумение, учитывая, что он также контролирует транспортировку компонентов нескольких сигнальных путей, таких как Tkv. Lgd функционально взаимодействует с Shrub, потеря функции которого затрагивает несколько сигнальных путей в клетках имагинального диска. Таким образом, можно предположить, что эти пути также активируются в lgd мутантных клетках.Это исследование показывает, что путь Dpp эктопически активируется при потере функции lgd в яичнике. Эта активация происходит как в FC, так и в GC. В мутантных GCs lgd активируется только путь Dpp, а не Notch. Это наблюдение отличается от того, что было описано для мутантов компонента ESCRT-II Vps25, где передача сигналов Dpp усиливалась, но этот путь не активировался эктопически (Morawa, 2015).

В этом исследовании не удалось обнаружить какой-либо фенотип, который мог бы быть связан с наблюдаемой эктопической активацией пути Dpp в lgd мутантных FC, но его эктопическая активация в мутантной зародышевой линии вызывает дополнительный раунд клеточного деления. Кроме того, наблюдалось большее количество GSC, а экспрессия Bam-GFP была подавлена ​​во фракции germaria. Эти находки предполагают, что диапазон сигнала Dpp расширен и, таким образом, поддерживает судьбу GSC в более отдаленно расположенных клетках (Morawa, 2015).

Недавно было показано, что активируемая Dpp форма рецептора Tkv специфически разрушается в кистозных клетках для подавления эктопической активации пути. Эта деградация через эндосомальный путь опосредована комплексом, состоящим из лигазы E3 Smurf и Fu, и ограничивает активность пути к GSCs в нише клеток крышки.Потеря функции fu вызывает потерю деградации активированного рецептора в потомках GSCs и, таким образом, увеличивает диапазон пути в GCs. Следовательно, эктопическая активация происходит автономно, но индуцируется лигандом Dpp. Эктопическая активность, индуцированная потерей функции fu , вызывает множество фенотипов, включая яйцевые камеры, которые содержат 32 GCs, что наблюдалось при потере функции lgd . Было показано, что потеря функции lgd приводит к нарушению деградации Tkv и других грузовых белков, таких как Notch и D1, в FC и GC.Это исследование также показало, что диапазон пути Dpp увеличивается в отсутствие функции lgd . Поэтому вполне вероятно, что активация пути вызвана общей недостаточностью деградации, которая также влияет на деградацию активированной формы Tkv. В подтверждение этой точки зрения, генетические взаимодействия были обнаружены между fu , lgd и кустарником (Morawa, 2015).

Было высказано предположение, что в клетках lgd трансмембранные белки, предназначенные для деградации в лизосомах, не полностью включены в ILV MEs (Schneider, 2013).Эта гипотеза была сильно подтверждена недавней работой лаборатории Швайсгута (Couturier, 2014). Следовательно, часть Notch и Tkv остается на LM, а их внутриклеточные домены остаются в контакте с цитозолем. Активированный Tkv в этой фракции продолжает сигнализировать, пока существует ME. Поэтому предполагается, что дефект включения активированного Tkv в ILV вызывает эктопическую активацию пути Dpp. В этом сценарии дефекты, увеличивающие время жизни мутантного ME lgd , такие как потеря функции Dmon1 , усиливают и продлевают активность пути Dpp.Вот что было замечено. Включение трансмембранных белков в ILV требует их предварительного убиквитинирования лигазами E3. Следовательно, потеря функции E3 лигазы Fu, которая в норме убиквитилирует активированный Tkv, также препятствует включению активированного Tkv в ILV (Morawa, 2015).

Потеря функции куста вызывает дефект, аналогичный дефекту lgd . Кустарник является центральным элементом комплекса ESCRT-III, который необходим для расщепления ИЛВ и физически взаимодействует с Lgd (Troost, 2012).Ожидается, что потеря функции куста приведет к тому, что все Tkv останутся на LM. Таким образом, неудивительно, что потеря его функции в FC также вызывает активацию пути Dpp. Более удивительным было обнаружение того, что снижения активности Shrub всего на 50% достаточно, чтобы инициировать активацию пути Dpp в зародышевой линии. Учитывая, что фенотипы клеток -Brush /+ сильнее, чем фенотипы мутантных клеток -lgd , вполне вероятно, что снижение активности -Brush на 50% приводит к тому, что на LM остается большая доля Tkv, чем в lgd мутантные клетки.Фенотипы клеток кустарника /+ сильно усиливаются за счет гетерозиготности fu , что указывает на тесную функциональную связь и на то, что, как и в случае lgd , дефект деградации Tkv вызывает активацию Dpp. путь (Морава, 2015).

Из-за схожести фенотипа и их близкого родства трудно найти антагонистические отношения между кустарником и lgd .Однако этот антагонизм наблюдался только в отношении образования сверхштатных ГСК, но не в отношении образования сверхштатных dаd -lacZ-позитивных ГСК. Аналогичная сложная ситуация была обнаружена для взаимоотношений lgd и lgd в имагинальных дисках, где снижение активности lgd подавляло активацию пути Notch, но усиливало морфологический дефект эндосом в клетках lgd ( Троост, 2012). Поиск объяснения этой сложной взаимосвязи будет ключом к пониманию функции Lgd.Одна возможность состоит в том, что функция МЭ нарушена более серьезно у двойных мутантов, чем у каждого одиночного мутанта. С этим согласуется наблюдение в имагинальном диске, где МЭ потеряли свою ассоциацию с Rab7 в кустарниковых lgd/lgd + клетках (Morawa, 2015).

Апикальный внеклеточный матрикс играет центральную роль в морфогенезе эпителиальных трубок.В системе трахеи Drosophila, Serpentine (Serp), секретируемая хитиндеацетилаза, экспрессируемая клетками трахеи, играет ключевую роль в регуляции длины трубки. Это исследование показывает, что жировое тело мух, которое функционально эквивалентно печени млекопитающих, также способствует морфогенезу трахеи. Serp экспрессируется жировым телом, а секретируемый Serp поглощается клетками трахеи и перемещается в просвет для функциональной поддержки нормального развития трахеи. Этот процесс дефектен у мутантов rab9 и bust/vps32 , а также у эмбрионов дикого типа, обработанных ингибитором секреторного пути, что приводит к обильному накоплению Serp в жировом теле.Serp, происходящий из жировых тел, достигает просвета трахеи после установления эпителиальной барьерной функции и удерживается в просвете зависимым от хитинсинтазы образом. Таким образом, эти результаты показывают, что жировое тело, мезодермальный орган, активно способствует развитию трахеи (Dong, 2014).

Разнообразие нейрональных клеток, особенно по размеру и форме их дендритных и аксональных разветвлений, является поразительной особенностью зрелой нервной системы.Ветвление дендритов представляет собой сложный процесс, и основные механизмы передачи сигналов еще предстоит определить на механистическом уровне. В этой статье сообщается об идентификации мутаций куста , которые увеличили ветвление дендритов. Одноклеточные клоны сенсорных нейронов куста с мутантным разветвлением дендритов (DA) у личинок дрозофилы показали эктопическое ветвление дендритов и аксонов, что указывает на клеточно-автономную функцию кустарника в морфогенезе нейронов. куст кодирует эволюционно законсервированный спиральный белок, гомологичный дрожжевому белку Snf7, ключевому компоненту комплекса ESCRT-III (комплекс эндосомальной сортировки, необходимый для транспорта), который участвует в формировании эндосомальных компартментов, известных как мультивезикулярные тельца (MVB). ).Мышиные ортологи могут замещать Shrub у мутантных эмбрионов Drosophila, и потеря функции Shrub вызывает аномальное распределение нескольких ранних или поздних эндосомальных маркеров в сенсорных нейронах DA. Эти находки демонстрируют, что новый спиральный белок Shrub функционирует в эндосомальном пути и играет существенную роль в морфогенезе нейронов (Sweeney, 2006).

Комплексы ESCRT были связаны с несколькими эральные нейродегенеративные заболевания. Наследственный спастический белок параплегии Спастин взаимодействует с CHMP1B, Эндосомальный белок, связанный с комплексом ESCRT-III (Рейд, 2005).Специфическая мутация внутри ЧМП2Б ген, кодирующий ортолог Vps2, другой компонент комплекса ESCRT-III, обнаружен в датская семья лобно-височной деменции (Skibinski, 2007). Дальше понимание молекулярных и физиологических последствий дефектов в комплексах ESCRT может предложить новое понимание возрастной нейродегенеративной расстройства (Суини, 2006)

Кассон, Мэтт | Колледж сельского хозяйства, природных ресурсов и дизайна Дэвиса

Директор Международной коллекции культур (везикулярных) арбускулярных микоризных грибов (ИНВАМ)

Др.Кассон получил докторскую степень. получил степень доктора патологии растений в Университете штата Пенсильвания, где его исследования были сосредоточены на использовании местного грибка Verticillium nonalfafae в качестве биологического средства борьбы с инвазивным деревом Ailanthus altissima (небесное дерево). Он также имеет степень A.A.S. из Колледжа Пола Смита и степень бакалавра наук. и М.С. из Университета штата Мэн. Его текущие области исследований включают взаимодействие грибов и членистоногих, биологическую борьбу с инвазивными растениями и патогенами, а также биологию и экологию исторических и возникающих болезней лесных деревьев.Доктор Кассон в настоящее время является временным директором Международной коллекции культур (везикулярных) арбускулярных микоризных грибов (INVAM) и в настоящее время занимается исследованиями метаболитов, связанных с взаимодействием между арбускулярными микоризными грибами и их растениями-партнерами. Доктор Кассон преподает курсы для студентов по общей патологии растений и борьбе с лесными вредителями, а также предлагает курсы по специальным темам для аспирантов, включая углубленную диагностику болезней растений.

Выберите публикации

1. Кассон, М.Т. , Кассон, Л. Р., Викерт*, К.Л., Дэвис, Д.Д., Стаджич, Дж.Е., (2019). Последовательность генома смертельного грибка сосудистого увядания, Verticillium nonalfafae , Биологическая борьба с инвазивным Ailanthus altissima. Объявления о микробиологических ресурсах, ( только что принятый).
2. Штаудер*, К.М., Насс, Д.Л., Чжан, Д.С., Дабл, М.Л., Макдональд, В.Л., Метени*, ЯВЛЯЮСЬ. и Кассон, М.Т. , (2019). Усиленная передача гиповируса за счет инженерных штаммы-супердоноры фитофтороза каштанов, Cryphonectria parasitica , в естественную популяцию штаммов, проявляющих генотипы разнообразной вегетативной совместимости.Вирусология, 528: 1-6.
3. Wickert*, K.L., Metheny*, A.M., Davis, D., Geiser, D., Wenzel, J.W., Planinsek, Д. и Кассон, М.Т. , (2018). Первое сообщение о поражении стебля фузариозом Pyularia pubera , редкий аборигенный кустарник-паразит в лесах юго-западной Пенсильвания. Болезни растений, 102: 1852.
4. Викерт*, К.Л., О’Нил, Э.С., Дэвис, Д.Д., Кассон, М.Т. , (2017). Производство семян, жизнеспособность и репродуктивные пределы инвазивного Ailanthus altissima (Небесное дерево) в захваченной среде.Лесов, 8: 226.
5. Шорт**, Д.П., О’Доннелл, К., Стаджич, Дж.Э., Халкр, Дж., Киджимото, Т., Бергер*, М.К., Масиас*, А.М., Шпар*, Э.Дж., Бейтман, К.С., Эскален, А., Линч, С.К., Коньято, А. И., Купербанд М. Ф., Кассон, М.Т. , (2017). Мультиплексы ПЦР различают симбионты Fusarium инвазивных жуков Euwallacea Ambrosia, которые наносят ущерб многочисленным деревьям Виды на всей территории Соединенных Штатов. Болезни растений, 101: 233-240.
6. Кассон, М.Т. , Викерт*, К.Л., Штаудер*, К.М., Масиас*, А.М., Бергер*, М.К., Симмонс, Д.Р., Шорт**, Д.П., ДеВалланс, Д.Б. и Халкр, Дж., (2016). взаимность с агрессивным дереворазрушающим Flavodon ambrosius (Polyporales) облегчает нишу экспансия и общественная социальная структура жуков Ambrosiophilus ambrosia. Грибковый Экология, 23: 86-96.
*Обозначает аспиранта/ **постдок.

Везикулы – определение, структура, функции и схема

Главная » Клеточная биология » Везикулы – определение, структура, функции и схема

• Чтобы выжить, клетки должны быть способны перемещать молекулы, переваривать частицы и выделять материалы.Для многих клеточных функций используются везикулы.
• Это небольшой сферический компартмент, отделенный от цитозоля по крайней мере одним двойным липидным слоем.
• Многие везикулы образуются в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме или образуются из частей клеточной мембраны путем эндоцитоза.
• Поскольку везикулы состоят из фосфолипидов, они могут отрываться и сливаться с другим мембранным материалом. Это позволяет им служить небольшими транспортными контейнерами, перемещающими вещества по клетке и к клеточной мембране.
• Примеры везикул включают секреторные везикулы, транспортные везикулы, синаптические везикулы, лизосомы и т. д.

Липосома (слева) и дендримерсома. Синие части их молекул гидрофильны, зеленые – гидрофобны.

Предоставлено: Изображение предоставлено Пенсильванским университетом

Везикула представляет собой небольшую структуру внутри клетки, состоящую из жидкости, окруженной двойным липидным слоем.Мембрана, окружающая везикулу, также представляет собой ламеллярную фазу, похожую на фазу плазматической мембраны. Пространство внутри пузырька может химически отличаться от цитозоля. Именно внутри пузырьков клетка может выполнять различные метаболические действия, а также транспортировать и хранить молекулы.

• Секреторные везикулы содержат материалы, которые должны выводиться из клетки, такие как отходы или гормоны. Секреторные везикулы включают синаптические везикулы и везикулы в эндокринных тканях.
• Транспортные везикулы перемещают молекулы внутри клеток. Все клетки производят белки и требуют, чтобы они функционировали. Белки образуются на рибосомах. Когда белки произведены, они упаковываются в транспортные везикулы и перемещаются в аппарат Гольджи, где их можно модифицировать и сортировать перед отправкой в ​​конечный пункт назначения клетки.
• Вакуоли — это пузырьки, содержащие в основном воду. Растительные клетки имеют большую центральную вакуоль в центре клетки, которая используется для осмотического контроля и хранения питательных веществ.Сократительные вакуоли обнаруживаются у некоторых простейших, особенно у Phylum Ciliophora. Эти вакуоли берут воду из цитоплазмы и выделяют ее из клетки, чтобы избежать разрыва из-за осмотического давления.
• Лизосомы представляют собой клеточные везикулы, содержащие пищеварительные ферменты. Лизосомы используются клетками для расщепления пищевых частиц и избавления от ненужных клеточных материалов.
• Пероксисомы представляют собой везикулы, использующие кислород для расщепления токсичных веществ в клетке.В отличие от лизосом, образованных аппаратом Гольджи, пероксисомы самореплицируются, увеличиваясь в размерах и затем делясь. Они распространены в клетках печени и почек, расщепляющих вредные вещества. Пероксисомы названы в честь перекиси водорода (H ₂ O ₂ ), которая образуется при расщеплении органических соединений. Перекись водорода токсична и, в свою очередь, распадается на молекулы воды (H ₂ O) и кислорода (O ₂ ).

• Везикулы хранят и транспортируют материалы вместе с клеткой.Некоторые из этих материалов транспортируются к другим органеллам; другие материалы секретируются из клетки. Большинство везикул участвуют в транспортировке некоторых молекул, таких как гормоны или нейротрансмиттеры.
• Транспортные везикулы играют центральную роль в перемещении молекул между различными окруженными мембраной компартментами секреторного пути.
• Поскольку везикулы состоят из двойного липидного слоя, они могут иметь полностью автономную среду, отличную от внутренней среды клетки.Таким образом, везикулы также участвуют в метаболизме и хранении ферментов.
• Он участвует в контроле плавучести и временном хранении пищи и ферментов.
• Они также могут использоваться в качестве химических реакционных камер.
• Вакуоли отвечают за выделение из клетки веществ, которые могут быть для нее вредными, а также содержат в себе продукты жизнедеятельности. В качестве аутофагической везикулы функция этой клеточной органеллы состоит в том, чтобы поглощать и уничтожать любые вторгшиеся бактерии. Он также отвечает за поддержание тургорного давления и значения рН клетки.
• Лизосомы — это специализированные органеллы, содержащие пищеварительные ферменты, которые используются для расщепления веществ в клетке на более мелкие молекулы.

1. Верма, П.С., и Агравал, В.К. (2006). Клеточная биология, генетика, молекулярная биология, эволюция и экология (1-е изд.). С.Чанд и компания ООО
2. Альбертс, Б. (2004). Основная клеточная биология. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: научный паб Garland.
3. Кар, Д.К. и Гальдер, С. (2015). Клеточная биология Генетика и молекулярная Биология .kolkata, Новое центральное книжное агентство
4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9886
5. Альбертс, Брюс, Джонсон, Александр, Льюис, Джулиан, Рафф, Мартин, Робертс, Кейт и Уолтер, Питер (2008). Молекулярная биология клетки (пятое издание), (Garland Science, Нью-Йорк), с. 789
6. https://www.ck12.org/biology/Vesicles-and-Vacuoles/lesson/Vesicles-and-Vacuoles-Advanced-BIO-ADV/
7. https://исследование.com/academy/lesson/vesicles-definition-function-quiz.html

Везикулы — определение, структура, функции и схема

Изменения фитогормонов у Bouteloua gracilis, инфицированного везикулярно-арбускулярной микоризой.

Цитируется по

1. Двойные инокуляции арбускулярных микоризных грибов и стимулирующих рост растений ризобактерий повышают засухоустойчивость и выход эфирного масла мирта обыкновенного

2. Влияние эндомикоризных грибов на рост тропических видов растений Грибы в развитии корней с новым измерением в сети корневой паутины

4. Арбускулярная микориза, но не гидрогель, смягчает стресс от засухи декоративных растений в торфяном субстрате

5. Арбускулярный микоризный симбиоз и слизь семянки выполняют независимые функции в росте проростков пустынного кустарника производство масла и поглощение фосфора Salvia officinalis L.

8. Изучение механизмов усиленного производства ценных терпеноидов арбускулярной микоризой

9. Анализ экспрессии генов в томатах, близких к изогенным линиям, свидетельствует о тонкой настройке биосинтеза этилена и абсцизовой кислоты во время развития арбускулярной микоризы Сообщества микоризы как вклад в органическое сельское хозяйство

12. Первичный метаболизм в симбиозе арбускулярной микоризы

13. Воздействие арбускулярных микоризных грибов на стручковый перец виды

14.

14. Arbuscular MyCorrhiza Разновочно влияет на синтез эфирных масел в кориандре и укропом

15.

15. Везикулярно-арбускулярные микоричевые и почвенные микробные взаимодействия

16. Важность арбускулярного микоризации для цикламен PURPURACSINGS SUBSP. immaculatum, эндемичный в Словакии

17. Микоризоремедиация летучей золы с помощью Paspalum scrobiculatum L., инокулированные Rhizophagus fasciculatus

18. Может ли микоризная инокуляция стимулировать рост и цветение декоративных растений, выращенных на торфе, при стандартном или уменьшенном поливе?

19. Роль арбускулярных микоризных грибов в смягчении солевого стресса

20. Продуктивность перца (Capsicum annuum L.) под влиянием органических удобрений, соляризации почвы и эндомикоризы

200. Арбускулярный микоризный симбиоз и действующие вещества лекарственных растений: состояние исследований и перспективы

22. Гормоны растений в арбускулярно-микоризных симбиозах: возрастающая роль гиббереллинов

23. СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО ПИНУС СИЛЬВЕСТРИС Л. САЖАНЦЫ, ИНОКУЛИРОВАННЫЕ HEBELOMA CRUSTULINIFORME И LACCARIA BICOLOR

24. Биоудобрения: устойчивый экологически чистый сельскохозяйственный подход к улучшению урожая

25. Повышение нутрицевтической ценности пищевых продуктов с помощью растительных симбионтов

26. Арбускулярный микоризный симбиоз для устойчивого культивирования китайских лекарственных растений: многообещающее направление исследований

27. Чистая культура Metarhizium anisopliae LHL00007 солевой стресс

28. Сверхэкспрессия мРНК белка арбускулярной микоризы в проростках мягкой пшеницы Trichoderma harzianum Raifi (KRL-AG2) выявление

29. Вклад арбускулярного микоризного симбиоза в засухоустойчивость растений: состояние дел

30. Мелиоративный симбиоз эндофита (Penicillium funiculosum LHL06) в условиях солевого стресса повышенный рост растений Glycine max L.

Arbusal mycorrhyal Association 07. в Solanum Centrale (кустарниковый томат), многолетнем полукустарнике из засушливой зоны Австралии

32. Микоризная колонизация влияет на содержание фенолов и антиоксидантные свойства листьев и цветков артишока через два года после полевой пересадки

33. Реакция роста и использование питательных веществ проростками Casuarina equisetifolia, инокулированными биоинокулянтами в условиях тропического питомника 36. Гормональные реакции растений-хозяев, вызванные арбускулярными микоризными грибами

37. Роль микоризных грибов в стимуляции роста сельскохозяйственных культур

38. Глобальные и клеточные профили экспрессии генов в растениях томатов, колонизированных арбускулярным микоризным грибом

39. Эффекты трех видов Glomus в качестве агентов биоконтроля против вертициллезного увядания хлопка

40. Реакция растений на засуху и экзогенное применение АБК по-разному модулируется микоризацией томата и мутанта с дефицитом АБК (Sitiens)

42. Микоризные грибы: что мы знаем и что мы должны знать?

43. Регуляция арбускулярной микоризации апопластными инвертазами: повышенная инвертазная активность в апопласте листа влияет на симбиотическое взаимодействие части растений АМ: что мы знаем и куда двигаться?

46. Арбускулярные микоризные грибы могут индуцировать производство фитохимических веществ в базилике независимо от фосфорного питания

47. Микоризные грибы: пути для воды и питательных веществ в засушливых почвах

48. Реакция земляники на инокуляцию арбускулярными микоризными грибами в условиях очень высокого содержания фосфора в почве Campanula rotundifolia

50. Перспективы и ограничения использования микоризы в биологической борьбе с корневыми патогенами

51. Разнообразие арбускулярных микоризных грибов и функционирование экосистемы

52. Интерактивное влияние эндомикоризного гриба Glomus etunicatum и фосфорных удобрений на рост и метаболическую активность растений бобов в условиях засушливого стресса

53. Glomus intraradices *

54. Локальное и системное влияние арбускулярных микоризных грибов на защитные реакции растений томата на фитофтороз

56. Биотехнологии арбускулярных микоризов

57.

57. Обороны растений Обороны, вызванные арбикулярными микоризными грибами

58. Органические взаимодействия и растительные водные отношения

59. Роль микоризировальных грибов в составе и динамике растительных сообществ. : A Scaling Issue

60. Respostas fisiológicas em mudas de maracujazeiro amarelo (Passiflora edulis Sims. f. flavicarpa Deg.) inoculadas com fungos micorrízicos arbusculares e submetidas a estresse hidrico

Микоризные ассоциации и манипулирование ими для долгосрочной сельскохозяйственной стабильности и продуктивности *

63. Содержание ИУК и ZR в луке-порее (Allium porrum L.) под влиянием фосфорного питания и арбускулярной микоризы в связи с развитием растений

64. арбускулярная микориза и фосфор

65. везикулярных арбускулярных микоризальных грибов улучшает создание микропропинированных растений

66. , вызванные микоризой изменений в выражении тяжести заболеваний и белкости и белкости заболевания в листьях табака

67. Регулирование формирования арбускуля у углерода на заводе

68. Влияние отдельных растительных гормонов на пролиферацию in vitro гиф Glomus fistulosum

69. Влияние арбускулярной микоризы и Rhizobium на уровни свободных полиаминов и пролина в люцерне, испытывающей дефицит воды

70. Вещества, регулирующие рост растений в ризосфере: микробное производство и функции

71. Везикулярно-арбускулярные микоризные (ВАМ) грибы

72. Влияние арбускулярной микоризы (АМ) на здоровье L. usita, инфицированного L. usita патогены

73. Экология арбускулярной микоризы: взгляд в 20 век и взгляд в 21 век Вклад гиф в поглощение воды микоризными растениями в зависимости от вида грибов и водного режима

76. Роль фитогормонов в функции и биологии микориз

77. Распространение и экологическое значение микоризного симбиоза Растения

78. Демонстрация абсцизовой кислоты в спорах и гифах арбускулярно-микоризного гриба Glomus и в N2-фиксирующей цианобактерии Anabaena variabilis

79. Водные отношения и смягчение засушливого стресса у микоризных растений

80. Влияние везикулярно-арбускулярной микоризы на баланс фитогормонов у кукурузы (Zea mays L.)

81. VA морфология корней и инфекционная функция корней и инфекция систем

82. Засухоустойчивость микоризных растений перца независимо от концентрации фосфора в листьях — реакция газообмена и водных отношений

83. Влияние везикулярно-арбускулярной микоризной инфекции на транспирацию, фотосинтез и рост льна Л.) в зависимости от уровня цитокинина

84. Внеклеточная абсцизовая кислота, продуцируемая цианобактериями в условиях солевого стресса

85. Микориза и повторное воздействие засухи влияют на засухоустойчивость и развитие экстрарадикальных гиф независимо от размера растения и содержания питательных веществ0 908

86. Анализы содержания индолуксусной и абсцеиновой кислот в клубеньках растений сои с микоризой VA

87. Регуляция микоризной инфекции гормональными факторами, продуцируемыми хозяевами и грибами

88. Регуляция переноса питательных веществ между хозяином и грибом в везикулярно-арбускулярной микоризе

89. Роль потребности в фотосинтезе эктомикоризы в реакции проростков пихты Дугласовой на высыхание почвы

90. Митотический цикл в апикальных меристемах Allium porrum L. контролируется эндомикоризным грибом Glomus sp. штамм E3

91. 6 Метаболизм углерода в микоризе

92. Поглощение цинка кукурузой при поражении везикулярно-арбускулярной микоризой

93. Гидравлическая проводимость корней и содержание в ксилемном соке рибозида зеатина и абсцизовой кислоты в эктомикоризных проростках пихты Дугласа

94. Морфогенетические модификации, индуцированные микоризным грибом Glomus штамм E3 в корневой системе Allium porrum L

8

2 90.003 и реабилитация нарушенных засушливых почв: Процессы и методы

97. Эффективность трех теплолюбивых трав, используемых для восстановления растительного покрова отвала

98. Рассмотрение физиологии везикулярно-арбускулярной микоризы в селекции для повышения поглощения минералов растениями ответ Severinia buxifolia

101. Устойчивое сельское хозяйство: микробный потенциал — задача микробиолога

102. Влияние ризосферы на урожайность сельскохозяйственных культур

103. Фосфор питания на микорризировальной колонизации, фотосинтезе, росте и питательной состав цитровых арантиума

105. Физиология везикулярно-арбускулярных микоризных корней

106. MyCorrhizas и их значение в узловых азотных установках

107. ВЛИЯНИЕ ДВУХ ВИДОВ МИКОРИЗНЫХ ГРИБОВ VA НА ЗАСУХОУСТОЙЧИВОСТЬ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ*

108. Физиология корней везикулярно-арбускулярной микоризы

VAMP2 elisa kit | Набор ELISA для белка 2 мембраны, связанного с везикулами растений (VAMP2) NP_055047.2

НП_055047.2

[Другие продукты] Нуклеотид GenBank NCBI №

[Другие продукты] Вторичный номер доступа UniProt Связанный с UniProt номер доступа Молекулярный вес 12 663 Да Официальное полное имя NCBI ассоциированный с везикулами мембранный белок 2 Полные имена официальных синонимов NCBI ассоциированный с везикулами мембранный белок 2 Информация о белках NCBI ассоциированный с везикулами мембранный белок 2 Название белка UniProt Ассоциированный с везикулами мембранный белок 2 UniProt Синоним Названия белков Синаптобревин-2 UniProt Synonym Gene Names Имя записи UniProt ВАМП2_ЧЕЛОВЕК Сводка NCBI для VAMP2 Белок, кодируемый этим геном, является членом семейства мембранных белков, ассоциированных с везикулами (VAMP)/синаптобревин. Синаптобревины/ВАМП, синтаксин и синаптосомально-ассоциированный белок SNAP25 массой 25 кДа являются основными компонентами белкового комплекса, участвующего в стыковке и/или слиянии синаптических везикул с пресинаптической мембраной. Считается, что этот ген участвует в высвобождении нейротрансмиттера на этапе между стыковкой и слиянием. Белок образует устойчивый комплекс с синтаксином, синаптосомально-ассоциированным белком 25 кДа и синаптотагмином. Он также образует отдельный комплекс с синаптофизином. Это вероятный ген-кандидат для семейной детской миастении (FIMG) из-за его расположения на карте и потому, что он кодирует белок синаптических везикул того типа, который участвует в патогенезе FIMG.[предоставлено RefSeq, июль 2008 г.] Комментарии UniProt для VAMP2 VAMP2: член семейства мембранных белков, ассоциированных с везикулами (VAMP)/синаптобревин. Синаптобревины/ВАМП, синтаксин и синаптосомально-ассоциированный белок SNAP25 массой 25 кДа являются основными компонентами белкового комплекса, участвующего в стыковке и/или слиянии синаптических везикул с пресинаптической мембраной. Предполагается участие в высвобождении нейротрансмиттера на этапе между стыковкой и слиянием. Белок образует устойчивый комплекс с синтаксином, синаптосомально-ассоциированным белком 25 кДа и синаптотагмином.Он также образует отдельный комплекс с синаптофизином. Тип белка: Мембранный белок, интегральный; Везикул; Подвижность/полярность/хемотаксис Хромосомная локализация человека Ортолог: 17p13.1 Клеточный компонент: везикула, покрытая клатрином; цитоплазматический везикул; цитозоль; неотъемлемой частью плазматической мембраны; внутриклеточная мембраносвязанная органелла; мембрана; проекция нейрона; перинуклеарная область цитоплазмы; плазматическая мембрана; секреторная гранула; мембрана секреторных гранул; комплекс SNARE; синапс; синаптический пузырек; мембрана синаптических пузырьков; транс-Гольджи сеть; везикул; комплекс потенциалзависимых калиевых каналов; мембрана гранул зимогена Молекулярная функция: связывание с кальций-зависимым белком; связывание кальмодулина; связывание фосфолипидов; связывание белков; белковая самоассоциация; активность рецептора SNAP; привязка SNARE; связывание синтаксина; связывание синтаксин-1 Биологический процесс: экзоцитоз, зависящий от ионов кальция; клеточный ответ на инсулиновый стимул; дегрануляция эозинофилов; экзоцитоз; секреция глутамата; Гольджи к транспорту белков плазматической мембраны; дегрануляция естественных клеток-киллеров; секреция нейромедиаторов; дегрануляция нейтрофилов; транспорт, опосредованный везикулами после Гольджи; сборка белкового комплекса; белковый транспорт; регуляция экзоцитоза; ответ на глюкозный стимул; экзоцитоз синаптических пузырьков; слияние пузырьков; везикуло-опосредованный транспорт Меры предосторожности Все продукты MyBioSource предназначены для научных лабораторных исследований и не предназначены для диагностики, терапии, профилактики или использования in vivo. Покупая, вы прямо заявляете и гарантируете MyBioSource, что будете должным образом тестировать и использовать любые Продукты, приобретенные у MyBioSource, в соответствии с отраслевыми стандартами. MyBioSource и его авторизованные дистрибьюторы оставляют за собой право отказать в обработке любого заказа, если мы обоснованно считаем, что предполагаемое использование выходит за рамки наших приемлемых правил. Отказ от ответственности Несмотря на то, что были предприняты все усилия для обеспечения точности информации, представленной в этом листе данных, MyBioSource не несет ответственности за какие-либо упущения или ошибки, содержащиеся в нем.MyBioSource оставляет за собой право вносить изменения в данное техническое описание в любое время без предварительного уведомления. Клиент обязан сообщить MyBioSource о проблемах с производительностью продукта в течение 30 дней с момента получения продукта. Пожалуйста, посетите нашу страницу «Условия и положения» для получения дополнительной информации. Продукты, связанные с набором ELISA VAMP2 Пути, связанные с набором ELISA VAMP2 Заболевания, связанные с набором для ELISA VAMP2 Органы/ткани, связанные с набором ELISA VAMP2

Эффективный метод выделения внеклеточных везикул из лимона для лечения рака желудка | Journal of Nanobiotechnology

Материалы и реагенты

Мешок для диализа (300 кДа) был приобретен в Spectrum Labs (131450).Глицин (7,2 г/л) и трис (1,5 г/л) (Sangon Biotech) использовали для приготовления электрофоретического буфера с деионизированной водой. Блоки питания и камеры для электрофореза были приобретены у компании Tanon.

Культура клеток

Линии клеток рака желудка AGS, BGC-823 и SGC-7901 были приобретены в Банке клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и культивированы в культуральной среде RPMI 1640 (Gibco; A10491). -01) с добавлением 10% ФБС и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Клетки культивировали в инкубаторе при 37°C с 5% CO ₂ .

Трехмерная (3D) сфероидная культура клеток рака желудка была выполнена в соответствии с предыдущим отчетом [41]. Вкратце, клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали. Затем 2000 клеток/лунку в 100 мкл среды, содержащей 10 % FBS и дополненной 0,25 % раствором метилцеллюлозы, высевали на U-образное дно, не обработанное тканевой культурой, 96-луночные планшеты, и выращивали в стандартных условиях культивирования (5 % CO ₂ , при 37 °C).

Приготовление лимонного сока

Лимоны были куплены на местном рынке и выжаты для получения сока. Сок последовательно центрифугировали при 3000× g в течение 10 мин и 10000× g в течение 20 мин. Супернатант фильтровали через фильтр с порами 0,22 мкм для выделения LDEV.

LDEV, выделенные с помощью ELD

Пять миллилитров отфильтрованного лимонного сока загружали в диализный мешок 300 кДа и запечатывали парафильмом. Мешок для диализа помещали в кассету держателя геля, и для выделения LDEV использовали силу тока 300 мА. Через 30 мин направление электрофореза меняли, а электрофоретический буфер заменяли. На достижение LDEV ушло два с половиной часа.

LDEV, выделенные ультрацентрифугированием

Профильтрованный лимонный сок центрифугировали при 100 000 g 4 °C в течение 2 ч для осаждения EV. Для получения очищенных ЭВ осадок ЭВ суспендировали в PBS и снова центрифугировали при 100 000 g в течение 2 ч. Затем осадок ресуспендировали в PBS.

Измерение Nanodrop

Концентрации белков и РНК всех фракций измеряли с помощью Nanodrop.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

LDEV (5 мкл) добавляли к сеткам 200 меш, покрытым формваром/углеродом, на 1 мин при комнатной температуре. Сетки высушивали с помощью фильтровальной бумаги. Для отрицательного окрашивания на сетки капали 5 мкл 2% ацетата уранила. Через 1 мин избыток раствора для негативного окрашивания был абсорбирован фильтровальной бумагой. Образцы просматривали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Tecnai G2 Spirit BioTwin (FEI).

Анализ слежения за наночастицами (NTA)

Количественное определение и определение размера LDEV проводили с использованием прибора NanoSight NS500 (Malvern).Прибор настроен на работу при комнатной температуре. Для каждого образца было записано три видео, и результаты были проанализированы с помощью программного обеспечения NTA.

Клеточное поглощение

Клетки рака желудка (5 × 10 ⁵ ) высевали в 6-луночный планшет для 2D-культуры и 96-луночный планшет для 3D-культуры. Затем в эти лунки добавляли меченные DiI (диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндодикарбоцианин) LDEV (10 мкг/мл). После инкубации в течение 6 ч при 4°С или 37°С клетки окрашивали Hoechst 33342 в течение 5 мин.Затем клетки трижды промывали PBS и фиксировали в 1% PFA. Клетки наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Анализ жизнеспособности

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора для подсчета клеток-8 (CCK-8). Вкратце, 1 × 10 ⁴ клеток рака желудка высевали в 96-луночный планшет и подвергали воздействию различных доз LDEV в течение 24 часов. Клетки, предварительно обработанные 5 мкмоль N -ацетилцистеина (NAC) в течение 20 минут, были обработаны и обработаны LDEV в течение 24 часов.Поглощение измеряли при 450 нм.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия использовалась для оценки клеточного цикла. Клетки AGS, BGC-823 и SGC-7901 (1 × 10 ⁶ ) обрабатывали 20 мкг/мл LDEV в течение 12 часов. Клетки собирали и фиксировали 70% этанолом при температуре - 20 °C в течение ночи перед окрашиванием йодидом пропидия (PI) (BD Biosciences; 550825) для анализа проточной цитометрии.

Проточная цитометрия использовалась для различения интактных и апоптотических клеток. Клетки на ранней и поздней стадиях апоптоза анализировали с помощью набора для обнаружения апоптоза с использованием аннексина V-FITC и PI (KeyGEN Biotech; KGA108).Клетки AGS, BGC-823 и SGC-7901 обрабатывали 20 мкг/мл LDEV в течение 24 ч, расщепляли 0,25% трипсином и один раз промывали в PBS. После ресуспендирования в буфере для связывания клетки окрашивали аннексином V-FITC и PI в течение 10 мин, а затем анализировали на проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences).

Вестерн-блоттинг

Белки разделяли с помощью 12,5% SDS-PAGE (EpiZyme; PG113) при постоянном напряжении 100 В при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Затем разделенные белки наносили на мембраны из ПВДФ (Bio-Rad; 1620177) при постоянном токе 300 мА в течение 1 часа.Мембраны блокировали раствором для быстрой блокировки (Beyotime Biotechnology; P0222) в течение 15 мин, затем инкубировали с первичными антителами против каспазы 3 (1:1000; Cell Signaling Technology), расщепленной каспазой 3 (1:1000; Cell Signaling Technology) и GADD45α ( 1:500; BOSTER Biological Technology) при 4°C в течение ночи. После промывки мембраны затем инкубировали с мечеными HRP, разведенными 1:5000 козьими антикроличьими (ZSGB Bio.; ZB-2301) или антимышиными (ZSGB Bio.; ZB-2305) вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 ч. .Наконец, мембраны визуализировали с помощью системы обнаружения хемилюминесценции с улучшенными характеристиками (Tanon; 5200CE).

Анализ образования колоний на чашках

Всего 800 клеток AGS, BGC-823 и SGC-7901 культивировали в 6-луночных планшетах. Через двадцать четыре часа культуральную среду заменяли свежей средой для культивирования клеток с добавлением 1 мкг/мл LDEV, и клетки культивировали в течение 2 недель. Колонии фиксировали и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым (Sangon Biotech; 548-62-9). Способность к образованию колоний оценивали по размеру и плотности колоний.

Анализ живых мертвецов

Трехмерные культивированные сфероиды клеток рака желудка предварительно обрабатывали 20 мкг/мл LDEV в течение 24 часов. Затем кальцеин-АМ и PI совместно культивировали с клетками в течение 10 мин. Клетки тщательно промывали три раза PBS и наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии.

Секвенирование РНК

Клетки SGC-7901 обрабатывали LDEV в течение 6 или 12 часов. Суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента TRizol (Sigma; T9424-200ML). Секвенирование РНК и анализ данных были выполнены компанией Sangon Technology.

Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

Тотальную РНК экстрагировали из трех клеток рака желудка после лечения LDEV в течение 12 часов. Относительную экспрессию GADD45A определяли с помощью qRT-PCR с использованием стандартного набора SYBR Green RT-PCR Kit (Takara; RR037A, RR420A) в соответствии с инструкциями производителя. Праймер для GADD45A следующий: прямой праймер, GGATGCCCTGGAGGAAGTG; Обратный праймер, CTTCGTACACCCCGACAGTGA.

Определение активных форм кислорода (АФК)

Уровень клеточных АФК определяли с помощью диацетата 2′,7′-дихлорфлуоресцина (DCFH-DA).Клетки рака желудка предварительно обрабатывали LDEV в течение 12 часов. DCFH-DA (10 мкмоль) (Beyotime Biotechnology; S0033) культивировали с клетками в течение 20 мин при 37 °C. DCFH-DA наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Анализ смоделированного желудочного сока

Смоделированный желудочный сок был приобретен у Leagene Biotechnology. LDEV разбавляли имитацией желудочного сока 1:10 при 37 °C в течение 12 часов. Затем LDEV анализировали с помощью ПЭМ.

Внутрижелудочное введение

Голым мышам внутрижелудочно вводили 50 мкл электрофоретического буфера, свободный-DiR или LDEVs-DiR (50 мкг), по три мыши на группу.Мышей визуализировали через 6 ч и 24 ч и отображали флуоресцентный сигнал, объединенный со всем телом. Через 24 часа животных умерщвляли, собирали и визуализировали органы желудочно-кишечного тракта. Количественные флуоресцентные сигналы органов желудочно-кишечного тракта из групп со свободным DiR и LDEVs-DiR рассчитывали и отображали на статистическом графике.

Анализ биобезопасности

LDEV (50 мкг/мышь) или такой же объем электрофоретического буфера вводили внутривенно в хвост голым мышам BALB/c.Через 2 недели мышей умерщвляли и основные органы (сердце, печень, селезенку, легкие и почки) окрашивали гематоксилином и эозином (H&E).

Животные и модель опухоли

Исследования на животных проводились на самках голых мышей BALB/c в возрасте от 4 до 6 недель, приобретенных в Шанхайском центре лабораторных животных. Все мыши содержались в условиях отсутствия патогенов в помещениях для ухода за животными Шанхайской девятой народной больницы Медицинской школы Шанхайского университета Цзяо Тонг. Всего 2 × 10 ⁶ клеток SGC-7901 инъецировали в бока голых мышей.Когда средний объем опухоли достиг приблизительно 100 мм ³ , мышам вводили перитуморально LDEV (50 мкг/мышь) или такой же объем электрофоретического буфера каждые 2 дня в течение 1 недели. Через 19 дней мышей умерщвляли, а опухоли взвешивали. Объемы опухоли измеряли два раза в неделю и рассчитывали по следующей формуле: длина × ширина ² /2.

Статистический анализ

Результаты, выраженные здесь как среднее ± стандартное отклонение, были выполнены в трех повторностях.Программное обеспечение Graphpad Prism 7 использовалось для разработки статистического анализа данных. Этот анализ был выполнен с использованием критерия Стьюдента t с нормальным распределением. p  < 0,05 считали статистически значимым.

(PDF) Цитотоксические эффекты внеклеточных везикул, полученных из растительного сока, на различные типы опухолевых клеток

J. Funct. Биоматер. 2020, 11, 22 15 из 17

19. Ли, X.; Бао, Х .; Ван, З .; Ван, М .; Фан, Б.; Чжу, К.; Чен З. Биогенез и функция мультивезикулярных тел

в иммунитете растений.Фронт. Растениевод. 2018, 9, 1–17.

20. Му, Дж.; Чжуан, X .; Ван, Кью; Цзян, Х .; Дэн, З.Б.; Ван, Б.; Чжан, Л.; Какар, С .; Джун, Ю .; Миллер, Д.; и другие.

Межвидовая связь между растением и клетками-хозяевами кишечника мыши посредством съедобных растительных

экзосомоподобных наночастиц. Мол. Нутр. Еда Рез. 2014, 58, 1561–1573.

21. Сарва, К.К.; Дас, П.Дж.; Мазумдер, Б. Нановезикулярная формула Bhut Jolokia (самый острый стручковый перец):

Потенциальное противоартритное лекарство. Мнение эксперта. Наркотик Делив. 2014, 11, 661–676.

22. Раймондо С.; Населли, Ф .; Фонтана, С.; Монтелеоне, Ф.; Дико, А.Л.; Саева, Л.; Зито, Г.; Флюги, А .; Манно, М.;

ди Белла, Массачусетс; и другие. Нановезикулы, полученные из цитрусовых лимона, ингибируют пролиферацию раковых клеток и подавляют рост ксенотрансплантата CML

, индуцируя TRAIL-опосредованную гибель клеток. Онкотаргет 2015, 6, 19514–19527.

23. Fatima, Z. Состав и оценка эффективности геля этосом, насыщенного экстрактом барбариса Aristata.

Азиатская Дж. Фарм. 2017, 11, 176–183.

24. Анвар, Э.; Фархана, Н. Состав и оценка нагруженного фитосомами мальтодекстрина-гуммиарабика

Система микросфер для доставки экстракта Camellia sinensis. Молодой фарм. 2018, 10, С56–С62.

25. Квак, К.С.; Луна, Южная Каролина; Ли, М.С. Антиоксидантное, антимутагенное и противоопухолевое действие хвои

(Pinus densiflora). Нутр. Рак 2006, 56, 162–171.

26. Квон, Дж. Х. ; Ким, Дж.ЧАС.; Чой, SE; Парк, К.Х.; Lee, M.W. Ингибирующее действие фенольных соединений из

игл Pinus densiflora на производство оксида азота и PGE2. Арка фарм. Рез. 2010, 33, 2011–2016.

27. Парк Ю.С.; Чон, MH; Хван, HJ; Парк, М. Р.; Ли, С.-Х.; Ким, С.Г.; Ким, М. Антиоксидантная активность и анализ

проантоцианидинов из хвои сосны (Pinus densiflora). Нутр. Рез. Практика. 2011, 5, 281–287.

28. Чанг И.М.; Ким, М.Ю.; Парк, С.Д.; Парк, WH; Мун, Х.И. In Vitro оценка антиплазмодиальной активности Dendropanax morbifera

в отношении чувствительных к хлорохину штаммов Plasmodium falciparum.

Фитотерм. Рез. 2009, 23, 1634–1637.

29. Мун, Х.-И. Антидиабетические эффекты дендропаноксида из листьев Dendropanax morbifera Leveille у

нормальных крыс и крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином. Гум. Эксп. Токсикол. 2011, 30, 870–875.

30. Тан, X.; Рю, Х.K. Влияние экстрактов листьев Dendropanax morbifera на липидный профиль у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров

и высоким содержанием холестерина. J. Корейский соц. Пищевая наука. Нутр. 2015, 44, 641–648.

31. Хён Т.К.; Ким, М.-О.; Ли, Х .; Ким, Ю .; Ким, Э .; Ким, Ж.-С. Оценка антиоксидантных и противораковых

свойств Dendropanax morbifera Léveille. Пищевая хим. 2013, 141, 1947–1955.

32. Парк Б.-Ю.; Мин, Б.-С.; О, С.-Р.; Ким, Дж.-Х.; Ким, Т.-Дж.; Ким, Д.-Х.; Бэй, К.-ЧАС.; Ли, Х.-К. Выделение и

антикомплементарная активность соединений из Dendropanax morbifera. Дж. Этнофармакол. 2004, 90, 403–408.

33. Акрам М.; Ким, К.-А.; Ким, Э.-С.; Сайед, А.С.; Ким, CY; Ли, Дж. С.; Бэ, О.-Н. Мощное противовоспалительное

и обезболивающее действие хлороформного экстракта Dendropanax morbifera, опосредованное путем Nrf2/HO-1

. биол. фарм. Бык. 2016, 39, 728–736.

34. Ли Р.; Ко, Х.Дж.; Ким, К .; Зон, Ю.; Мин, С.Ю.; Ким, Дж. А.; На, Д.; Йон, Дж.Х. Антимеланогенные эффекты

внеклеточных везикул, полученных из листьев и стеблей растений, в клетках меланомы мыши и здоровой

коже человека. Дж. Экстраселл. Везикулы 2020, 9, 1703480.

35. Kim, H.-Y.; Ли, С.-Г.; О, Т.-Дж.; Лим, С.Р.; Ким, С.-Х.; Ли, Х.Дж.; Ким, Ю.-С.; Чой, Х.-К. Антипролиферативная

и апоптотическая активность экстракта листьев chamaecyparis obtusa в отношении клеточной линии колоректального рака человека HCT116

и исследование биоактивного соединения с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии на основе метаболомики

.Молекулы 2015, 20, 18066–18082.

36. Сух, Х.Р.; Чанг, HJ; Парк, EH; Луна, ЮЗ; Парк, SJ; Парк, CW; Ким, Ю.И.; Хан, Х.К. Влияние эфирного масла Chamaecyparis obtusa

на связанное с болью поведение и экспрессию провоспалительных цитокинов

при артрите, вызванном каррагинаном, у крыс. Бионауч. Биотехнолог. Биохим. 2016, 80, 203–209.

37. Ким С.К.; Ли, С.М.; Лим, Х.Б. Ослабляющий эффект эфирных масел листьев Chamaecyparis obtusa на дыхательные пути

Гиперреактивность и воспаление дыхательных путей в модели мышиной астмы, индуцированной овальбумином.