Пузыреплодник желтый: сорта и особенности — sdelayzabor.ru

Поиск в PubMed: Семенные пузырьки [И] семявыбрасывающий проток [название]

Просмотров страниц в 2021 году: 3,900

Просмотров страниц в 2022 году на сегодняшний день: 182

Процитируйте эту страницу: Matoso A.Семенные пузырьки/семяизвергающий проток. Сайт PathologyOutlines.com. https://www.pathologyoutlines.com/topic/prostateseminalves.html. По состоянию на 16 января 2022 г.

Определение / общее

• Семенные пузырьки представляют собой пару желез, расположенных под мочевым пузырем и соединенных с основанием предстательной железы
• Имеют трубчатую форму и могут складываться, образуя дивертикулы или выпячивания в стенке

Основные признаки

• Эпителий семенных пузырьков/эякуляторных протоков демонстрирует ядерную атипию, которая носит дегенеративный характер; также желтый пигмент в цитоплазме
• Выпячивание эпителия семенных пузырьков может дать начало скоплениям мелких желез, имитирующих рак предстательной железы
• Ключом к дифференциальной диагностике является распознавание дегенеративной ядерной атипии, характерного желтого пигмента и близлежащего эпителия семенных пузырьков

Клинические признаки

• Семенные пузырьки могут быть источником гипердиагностики, если они обнаружены в пункционной биопсии простаты или образцах ТУР

Микроскопическое (гистологическое) описание

• Семенной пузырь имеет толстую мышечную стенку, сложные складки слизистой оболочки, столбчатые и базальные клетки
• Цитоплазма содержит крупные крупные золотисто-желто-коричневые гранулы липофусцина/липохрома
• Столбчатые клетки также имеют нетипичный вид «монстровых» клеток с выраженной ядерной атипией и дегенеративным внешним видом, могут содержать гиалиновые глобулы (дегенеративные) (Am J Surg Pathol 1981; 5:483)
• Гранулы пигмента липохрома могут быть 1-го типа (крупные, золотисто-желто-коричневые, обычно в большом количестве, обычно в эпителии семенных пузырьков/эякуляторных протоков) или 2-го типа (мелкие, серо-коричневые или темные и скудные, иногда присутствуют в аденокарциномах предстательной железы или нормальные ацинусы простаты, Arch Pathol Lab Med 1999;123:1093, Hum Pathol 1995;26:1302)

Микроскопические (гистологические) изображения

Предстательная железа

Ядерный плеоморфизм

Желтый пигмент

Положительные окраски

• MUC6 и PAX2 положительны в семенных пузырьках и отрицательны в предстательной железе
• PSA и PSAP могут быть положительными как в семенных пузырьках, так и в предстательной железе

Дифференциальный диагноз

• Аденокарцинома предстательной железы:
  • Выпячивание эпителия семенных пузырьков может привести к образованию скоплений мелких желез, имитирующих рак предстательной железы
  • Ключом к дифференциальной диагностике является распознавание дегенеративной ядерной атипии, характерного желтого пигмента и близлежащего эпителия семенных пузырьков
    • При необходимости может помочь иммуногистохимия на MUC6 или PAX2

Криоэлектронная томография выявила критическую роль RIM1α в закреплении синаптических пузырьков | Журнал клеточной биологии

Синаптические везикулы встроены в сложную нитевидную сеть на пресинаптических окончаниях. Перед слиянием везикулы связаны с активной зоной (АЗ) короткими нитями (привязями). Идентичность молекул, которые формируют и регулируют связи, остается неизвестной, но Rab3-взаимодействующая молекула (RIM) является выдающимся кандидатом, учитывая ее центральную роль в организации AZ. В этой статье мы проанализировали пресинаптическую архитектуру мышей с нокаутом RIM1α (KO) с помощью криоэлектронной томографии. В отличие от предыдущей работы с обезвоженными, химически фиксированными образцами, наши данные показывают значительные изменения в распределении пузырьков и привязке AZ, которые могут обеспечить структурную основу для функционального дефицита синапсов RIM1α KO.Ингибирование протеасом реверсировало эти структурные дефекты, предполагая функциональное восстановление, подтвержденное электрофизиологическими записями. В целом, наши результаты не только указывают на убиквитин-протеасомную систему как на важный регулятор пресинаптической архитектуры и функции, но также показывают, что механизм привязки играет критическую роль в экзоцитозе, сходясь в структурной модели праймирования синаптических пузырьков с помощью RIM1α.

Пресинаптические окончания представляют собой специализации аксонов, в которых синаптические везикулы экзоцитозируются в ответ на индуцированный деполяризацией мембраны приток Ca ²⁺ .Высокая скорость синаптической передачи зависит от подмножества «примированных» везикул, которые сливаются в течение нескольких миллисекунд после притока Ca ²⁺ , т. н. легко высвобождаемый пул (RRP; Südhof, 2004). Слияние везикул происходит в активной зоне (АЗ), специализированном участке пресинаптической мембраны, прямо противоположном постсинаптической плотности. Тесная ассоциация примированных везикул с AZ, предпосылка для быстрого слияния, обеспечивается плотной сетью белков, известной как пресинаптический цитоматрикс (Schoch and Gundelfinger, 2006).

Методы 3D ЭМ выявили филаментную природу пресинаптического цитоматрикса (Landis et al. , 1988; Hirokawa et al., 1989; Siksou et al., 2007, 2009). Однако эти исследования проводились на обезвоженных образцах, которые могут подвергаться структурным изменениям (Dubochet and Sartori Blanc, 2001). Криоэлектронная томография (крио-ЭТ) позволяет получить трехмерную визуализацию с молекулярным разрешением полностью гидратированных биологических структур, оптимально сохраненных с помощью витрификации (Dubochet et al., 1988; Vanhecke и др., 2011). Кроме того, крио-ЭТ не требует окрашивания тяжелыми металлами, и поэтому биомолекулы визуализируются напрямую. С другой стороны, замороженные гидратированные образцы более чувствительны к радиационному повреждению, чем их аналоги, залитые пластиком, что налагает условия визуализации с низкой дозой электронов, что приводит к более высоким уровням шума. Кроме того, трудности, связанные с разбавлением замороженного гидратированного материала, часто ограничивают выбор образцов тонкими по своей природе образцами. Недавно мы использовали крио-ЭТ, чтобы показать, что в неокрашенных витрифицированных замороженно-гидратированных синапсах млекопитающих пресинаптический цитоматрикс в основном состоит из филаментов короче 40 нм, соединяющих везикулы друг с другом (коннекторы) или с АЗ (привязями; Fernández-Busnadiego et al. ., 2010).

В настоящее время идентичность белков, образующих и регулирующих эти филаменты, неизвестна. Наши предыдущие результаты (Fernández-Busnadiego et al., 2010) привели к модели, в которой везикулы сначала захватываются в AZ одной или несколькими привязями. Оказавшись поблизости от AZ, везикулы приобретают дополнительные, более короткие привязки, скорее всего, зависимым от SNARE способом. Расстояние между везикулами и АЗ уменьшается с увеличением количества нитей, что, как было показано, способствует слиянию (Li et al., 2007; ван ден Богарт и др., 2011). Т.о., везикулы с множественными короткими связками структурно загрунтованы и готовы к слиянию при втоке Ca ²⁺ .

В дополнение к SNARE в формировании привязи могут участвовать и другие белки AZ. Молекула, взаимодействующая с Rab3 (RIM), является важным кандидатом из-за ее центральной роли в организации AZ, поскольку она взаимодействует с каналами Ca ²⁺ , белками синаптических везикул и большинством других белков, обогащенных AZ (Mittelstaedt et al. , 2010; Ян и Фассхауэр, 2012 г.; Зюдхоф, 2012). Недавняя работа продемонстрировала, что RIM способствует праймированию везикул путем обращения гомодимеризации MUNC13 (Deng et al., 2011) и что RIM необходим для рекрутирования каналов Ca ²⁺ и закрепления везикул на AZ (Han et al., 2011; Kaeser et al. др., 2011).

В головном мозге присутствуют семь изоформ RIM (с несколькими вариантами сплайсинга). RIM1α, наиболее распространенная изоформа, особенно интересна тем, что мыши с нокаутом RIM1α (KO) страдают серьезным дефицитом синаптической передачи, памяти и обучения (Powell et al., 2004), более высокая склонность к эпилептическим припадкам (Pitsch et al., 2012) и шизофреноподобные черты поведения (Blundell et al., 2010). Срезы гиппокампа мышей RIM1α KO показали значительное снижение вероятности высвобождения в возбуждающих (Schoch et al., 2002) и тормозных синапсах (Kaeser et al., 2008), тогда как аутапсы (синапсы, созданные нейроном на себя) показали снижение RRP (Calakos et al. , 2004). Синапсы из других областей мозга также показали нарушение передачи (Mittelstaedt et al., 2010). Однако явного структурного фенотипа не наблюдается в химически фиксированных, обезвоженных и окрашенных тяжелыми металлами синапсах RIM1α KO или RIM1α/2α мышей с двойным KO (Schoch et al., 2002, 2006).

Недавняя работа показала, что убиквитин-протеасомная система (UPS) гомеостатически регулирует уровни RIM терминально-специфическим образом, коррелируя пресинаптические уровни RIM с синаптической активностью (Yao et al., 2007; Jiang et al., 2010; Лазаревич и др., 2011). Эти исследования также показали, что другие пресинаптические белки, такие как MUNC13 или синапсин, также являются мишенями UPS. Таким образом, помимо хорошо описанных ролей UPS в постсинаптической функции и нейродегенеративной патологии (Bingol and Sheng, 2011), UPS становится важным регулятором пресинаптической функции.

Здесь мы исследовали пресинаптическую архитектуру в синаптосомах, полученных из мозга RIM1α KO с использованием крио-ЭТ. Синаптосомы представляют собой широко распространенную модель высвобождения нейромедиаторов, которые могут поддерживать множественные экзоцитарные циклы (Whittaker, 1993; Nicholls, 2003). Хотя некоторые аспекты синаптической передачи, вероятно, нарушены в синаптосомах, мы ранее показали, что пресинаптические терминали синаптосом и органотипических срезов сравнимы с точки зрения количества и распределения пузырьков, а также организации пресинаптического цитоматрикса (Fernández-Busnadiego et al., 2010). Кроме того, в обоих препаратах длинные актиновые филаменты обычны постсинаптически, но не пресинаптически.Синаптосомы в настоящее время являются единственным препаратом, позволяющим крио-ЭТ исследование пресинаптической архитектуры с достаточной пропускной способностью, поскольку доступ к синапсам в органотипических срезах или диссоциированных культурах часто требует процедур прореживания с чрезвычайно низким выходом (Fernández-Busnadiego et al., 2011). Это исследование фокусируется на синапсах RIM1α KO, учитывая, что RIM1α является преобладающей изоформой RIM и что делеция дальнейших RIM вызывает летальность (Kaeser et al. , 2008; Mittelstaedt et al., 2010), тем самым препятствуя извлечению синаптосом.Чтобы проанализировать структурную роль UPS в пресинаптических окончаниях, мы изучили синапсы дикого типа (WT) и KO в присутствии ингибитора протеасом MG132. Мы провели количественный анализ томограмм с использованием ранее разработанного программного обеспечения, обеспечивающего объективное и всестороннее обнаружение и анализ соединителей и тросов (см. Материалы и методы; Fernández-Busnadiego et al., 2010), поскольку автоматический анализ данных особенно необходим для извлечения интересующих особенностей внутри многолюдных средах, таких как AZ.

Наши результаты показывают заметное снижение связывания пузырьков и концентрации пузырьков в AZ синапсов RIM1α KO, что может обеспечить структурную основу для функционального дефицита, наблюдаемого в этих окончаниях. С помощью крио-ЭТ и электрофизиологических записей мы показываем, что ингибирование протеасом устраняет эти структурные дефекты и повышает вероятность высвобождения до уровней WT. Ингибирование протеасом также индуцировало значительное увеличение связности везикул и диаметра везикул как в синапсах WT, так и в KO.Таким образом, наши данные указывают на UPS как на важный регулятор пресинаптической архитектуры и функции. Более того, наши результаты убедительно указывают на то, что механизм привязки играет критическую роль в экзоцитозе синаптических везикул, и предполагают структурный механизм праймирующего действия RIM1α.

Общая морфология витрифицированных замороженных гидратированных цереброкортикальных синаптосом однопометных мышей RIM1α KO и WT (рис.1, A, D и F) был сравним с ранее наблюдаемым в синаптосомах и органотипических срезах крыс (Fernández-Busnadiego et al., 2010). Диаметр и толщина синаптосом колебались от 0,5 до 1 мкм и от 300 до 500 нм соответственно. Мембраны выглядели гладкими и непрерывными, и не было признаков агрегации компонентов цитоплазмы, как и ожидалось для витрифицированных образцов. Терминалы обычно содержат 100–500 синаптических везикул, погруженных в плотный пресинаптический цитоматрикс, преимущественно образованный везикулярными соединителями и связками (рис.1, А, С и F).

Сначала мы сравнили распределение синаптических везикул в синапсах RIM1α KO и WT, измерив долю объема цитоплазмы, занятую везикулами (концентрация везикул). Все синапсы WT (рис. 1, A и B; и видео 1) показали характерный профиль концентрации везикул с максимумом вблизи AZ (0–45 нм) и минимумом в 45–75 нм от AZ ( n = 9; рис. 2 Б). Этот профиль концентрации был удивительно похож на наши предыдущие наблюдения в корковых синапсах крысы и использовался в качестве эталона для разделения пресинаптического терминала на четыре зоны, отражающие максимумы и минимумы, наблюдаемые в отдельных профилях: проксимальный (0–45 нм до AZ, где располагался максимум концентрации везикул), промежуточная (45–75 нм, содержащая минимум концентрации) и две дистальные зоны одинаковой толщины дальше от АЗ (первая: 75–150 нм, вторая: 150–250 нм; Фернандес-Буснадиего и др. , 2010). Мы называем везикулы в проксимальной зоне (0–45 нм до АЗ) проксимальными везикулами. Принимая во внимание все синапсы WT вместе, концентрация везикул была значительно ниже в промежуточной, чем в проксимальной и дистальной зонах (P <0,05 и P <0,01 по тесту t соответственно; рис. 2А).

В отличие от синапсов WT, KO-терминалы RIM1α демонстрируют значительную гетерогенность. Мы выделили две субпопуляции синапсов по наличию максимумов концентрации везикул в проксимальной зоне.Пять из девяти KO-синапсов (обозначенных KO-выровненными; рис. 1, F и G; и видео 3) показали максимумы концентрации везикул в проксимальной зоне и профиль концентрации везикул, примерно совпадающий с профилем WT-терминалов (рис. 2D). Другие синапсы КО (четыре из девяти, называемые измененными КО; рис. 1, D и E; и видео 2) показали заметно нарушенный профиль (рис. 2 C) с меньшей концентрацией везикул в проксимальной зоне на 60% по сравнению с синапсом. WT (P <0,05 по тесту t ; рис. 2A). Оба типа синапсов были обнаружены у всех проанализированных нокаутированных мышей.При объединении всех КО-синапсов концентрация везикул была снижена на 40% в проксимальной зоне ( n = 9, P < 0,05 по тесту t ; рис. 2А). В среднем это привело к снижению с 10,7 ± 1,8 (WT) до 4,9 ± 1,0 (все КО вместе) и 4,0 ± 0,9 (только измененные КО) проксимальных пузырьков на AZ (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; P <0,05 по тесту t ). в обоих случаях, рис. 3 А).

Различия между подгруппами КО, вероятно, не были основаны на их тормозном/возбуждающем характере, поскольку большинство синапсов имели заметную постсинаптическую плотность (WT: семь из девяти; выравнивание КО: четыре из пяти; измененное КО: четыре из четырех; рис.1, A, D и F), и не было обнаружено существенных различий в синаптической передаче между тормозными и возбуждающими синапсами у мышей RIM1α KO (Kaeser et al. , 2008). С другой стороны, эксперименты по иммуноокрашиванию показали, что доля пресинаптических окончаний (помеченных окрашиванием VAMP2/синаптобревин2), положительных по MUNC13, была снижена в синаптосомах RIM1α KO (P <0,001 по тесту t ; рис. S1, C и D), тогда как доля RIM1-позитивных терминалей увеличилась (P <0,001 по тесту t ; рис.S1, A и D), вероятно, из-за повышающей регуляции RIM1β (Kaeser et al., 2008). Другие белки AZ, такие как RIM2 или ELKS, не показали существенных различий (рис. S1, B и D). Следовательно, делеция RIM1α приводит к значительным изменениям в некоторых из оставшихся компонентов AZ в подмножестве синапсов, что, вероятно, способствует структурным различиям между подгруппами KO.

В соответствии с предыдущей работой (Schoch et al., 2002), средняя площадь AZ в синапсах KO была сравнима с таковой WT (рис. 3 B). Однако AZ был значительно больше у KO-измененных, чем у KO-выровненных терминалей (P <0,05 по тесту t ; рис. 3B). По сравнению с WT, средняя площадь AZ на проксимальный везикул показала трехкратное увеличение для всех окончаний KO (NS) и пятикратное увеличение только для измененных KO синапсов (P <0, 01 по тесту t ; рис. 3 C). Как было показано ранее на культурах нейронов (Schikorski and Stevens, 1997), количество проксимальных везикул хорошо коррелировало с площадью AZ у WT (корреляция Пирсона, P < 0.01 по т тест; табл. 1), тогда как в КО-терминалах эта корреляция полностью терялась (пирсоновская корреляция, P > 0,05 по тесту t ; табл. 1). Проксимальные везикулы выглядели случайным образом распределенными в АЗ и не группировались в определенных местах АЗ у всех животных (рис. 1, Б, Д и Ж). В совокупности эти результаты показывают, что делеция RIM1α вызывает серьезные изменения в распределении пузырьков и морфологии AZ.

Аналогично нашим наблюдениям в синаптосомах и органотипических срезах крыс (Fernández-Busnadiego et al. , 2010), проксимальные синаптические везикулы в синаптосомах мышей WT и KO в большинстве случаев были связаны с АЗ нитевидными связями (рис. 1, А, В, Е) и непосредственно мембрана к мембране контактировали с АЗ только во время экзопротезирования. /эндоцитоз. В среднем было 6,4 ± 1,1 везикул, прикрепленных к AZ в синапсах WT (среднее значение ± SEM; рис. 4A), что составляет 60% проксимальных пузырьков (рис. 4B). Это число было снижено до 1,7 ± 0,9 в КО-измененных терминалях (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; P <0,05 по тесту t ; рис.4 А). Количество привязей на единицу поверхности AZ также было резко снижено в синапсах, измененных KO (P <0,01 по тесту t ; рис. 4D). В KO-выровненных терминалях количество прикрепленных везикул на синапс было слегка уменьшено (NS), вероятно, из-за уменьшения общего количества проксимальных везикул (Fig. 2, A и D; и Fig. 3A).

Ранее мы предположили, что везикулы с множественными короткими связками структурно загрунтованы и относятся к RRP, поскольку эти везикулы были истощены гипертонической сахарозой (Fernández-Busnadiego et al. , 2010). Интересно, что популяция везикул с более чем двумя связями полностью отсутствовала в KO-измененных синапсах, тогда как в KO выровненных эти везикулы были так же обильны, как и у WT (Fig. 4C). В терминалях WT расстояние между везикулами и AZ было обратно пропорционально количеству нитей на везикулу (корреляция Пирсона, P <0,001 по тесту t ; табл. 2), тогда как эта корреляция была потеряна в RIM1α KO (корреляция Пирсона, P > 0,05 по тесту t (табл. 2).Фактически, длина привязи значительно увеличилась в синапсах KO (P <0,01 по тесту Крускала-Уоллиса [KW]; рис. 4E и рис. S2), а доля коротких привязей была значительно уменьшена (P <0,01 на χ ^{2). тест} ; рис. 4 F). Эта разница была более выражена в синапсах, измененных KO, в которых привязи были примерно на 70% длиннее, чем у WT (P <0,05 по тесту K-W; рис. 4E и рис. S2). Таким образом, наши данные показали значительные дефекты привязки в синапсах КО, которые были особенно заметны в подгруппе с измененными КО. Вместе со снижением концентрации проксимальных везикул эти дефекты привязки предполагают значительный дефицит высвобождения и снижение RRP в синапсов RIM1α KO — и, в частности, в KO-измененных синапсах — в соответствии с электрофизиологическими данными (Schoch et al., 2002; Calakos et al. , 2004).

Коннекторы соединяют ∼60% везикул друг с другом в терминалях WT. Связность увеличилась очень значительно во всех синапсах KO, как измеренная как доля связанных везикул (P <0.001 по т тест; Рис. 5 A) и среднее количество соединителей на везикулу (P <0,001 по тесту K-W; рис. 5 C). В проксимальной зоне связность увеличилась во всех синапсах KO, более заметно в случае с KO-выравниванием (P <0,01 по тесту t в обоих случаях; рис. 5B). Поскольку в КО-выровненных терминалях большинство проксимальных пузырьков были привязаны (P <0,01 по тесту χ ² ; рис. 4B), почти 80% проксимальных пузырьков в этих синапсах были как привязанными, так и связанными (P <0. 001by χ ² тест; Рис. 5 D и Рис. S2). Диаметр синаптических везикул увеличился во всех синапсах КО (P <0,001 по тесту t ; рис. S3, A и B), что привело к среднему увеличению объема везикул на 26% в терминалах КО. Т.о., отсутствие AZ-белка RIM1α нарушало архитектуру цитоматрикса и размер синаптических везикул не только в AZ, но и в более дистальных областях.

Протеасомы активны в синаптосомах мозга мыши (Upadhya et al., 2006; Тай и др., 2010). Чтобы исследовать роль UPS в пресинаптической архитектуре и его возможные структурные взаимодействия с RIM1α, мы проанализировали синаптосомы WT и RIM1α KO, обработанные обратимым ингибитором протеасом MG132 (10 мкМ; 30 мин при 37°C), наиболее широко используемым ингибитором протеасом. в синаптических исследованиях (Kalla et al., 2006; Yao et al., 2007; Jiang et al., 2010; Rinetti, Schweizer, 2010; Tada et al., 2010; Lazarevic et al. , 2011). Терминалы из мозга WT и RIM1α KO демонстрировали сходную протеасомную активность, которая в значительной степени подавлялась при инкубации с MG132 (рис.С4).

подтвердил, что RIM1α не обнаруживается в KO-концах (рис. 6). Как сообщалось ранее (Schoch et al., 2002; Kaeser et al., 2008), уровни MUNC13 были заметно снижены в RIM1α KO, тогда как другие пресинаптические белки, такие как RIM2, ELKS, Liprin2, Liprin3, Rab3, synaptotagmin1 или SNARE белки синтаксин-1, SNAP25 и VAMP2 оставались неизменными, а RIM1β активировался. Инкубация с MG132 индуцировала накопление убиквитинированных белков, которое было более заметным для нокаутированных мышей ( n = 3–4 пары однопометных мышей WT и нокаут для ELKS, липрин2, липрин3, Rab3, синаптотагмин1, синтаксин1, SNAP25, VAMP2 и убиквитин ).В соответствии с предыдущими исследованиями (Yao et al., 2007; Lazarevic et al., 2011), ингибирование протеасом вызывает умеренное повышение уровней RIM1α и MUNC13 в синапсах WT. Уровни RIM1β и MUNC13 повышались у обработанных MG132 KO-терминалов ( n = 7 WT и KO пар однопометных мышей), у которых также наблюдалось менее выраженное повышение уровней RIM2 при обработке MG132 ( n = 6 WT). и нокаутирующие пары однопометных мышей). Таким образом, снижение уровней критических факторов праймирования RIM и MUNC13, наблюдаемое в RIM1α KO, частично компенсировалось ингибированием протеасом.

Общая морфология синапсов, обработанных ингибитором протеасом MG132, была сравнима с контролем (рис. 7). У дикого типа MG132 практически не влиял на распределение и привязку пузырьков (рис. 2, А и Е; и рис. 4). Неожиданно в 12 из 14 KO-синапсов, обработанных MG132, распределение пузырьков было сравнимо с WT (Fig. 2F). Кроме того, корреляция между площадью AZ и количеством проксимальных пузырьков в терминалях KO, обработанных MG132, была восстановлена ​​​​до уровней WT (корреляция Пирсона, P <0. 01 по т тест; Таблица 1), а концентрация везикул значительно увеличилась в AZ (P <0,01 по тесту t ; рис. 2A), достигнув уровня WT. Таким образом, ингибирование протеасом в значительной степени реверсировало дефект распределения везикул, вызванный отсутствием RIM1α.

MG132 также вызвала значительное уменьшение средней длины привязи в KO терминалах (P <0,01 по тесту K-W; рис. 4E) и увеличила долю коротких привязей (P <0.01 по т тест; Рис. 4 F), что делает их сопоставимыми с WT. Кроме того, обратная корреляция между количеством привязок на везикулу и расстоянием везикулы до AZ была восстановлена ​​в терминалях KO, обработанных MG132 (корреляция Пирсона, P <0, 001 по тесту t ; таблица 2). Кроме того, KO-терминалы RIM1α, обработанные MG132, были неотличимы от WT по количеству прикрепленных везикул, доли прикрепленных везикул, связок на везикулу и связок на единицу поверхности AZ (рис. 4, А–Г). Следовательно, дефицит привязки, наблюдаемый в необработанных терминалах KO, был полностью устранен с помощью MG132.

Затем мы спросили, было ли структурное восстановление, наблюдаемое в KO терминалях RIM1α при лечении MG132, параллельным восстановлению пресинаптической функции. С этой целью мы исследовали стимуляцию парных импульсов (PPF) в срезах гиппокампа путем измерения потенциалов внеклеточного поля (полевые возбуждающие постсинаптические потенциалы [fEPSPs]) в области CA1.PPF представляет собой усиление высвобождения нейротрансмиттера в ответ на два близко расположенных стимула и обратно коррелирует с вероятностью высвобождения синаптических пузырьков (Thomson, 2000). В соответствии с предыдущей работой (Schoch et al., 2002), синапсы RIM1α KO показали значительное увеличение PPF (P <0,01 по тесту t ; рис. 8), что указывает на снижение вероятности высвобождения. Поразительно, что этот дефект был полностью устранен с помощью MG132 (P <0,01 по тесту t ; рис. 8), поскольку синапсы RIM1α KO, обработанные MG132, показали сравнимый PPF с синапсами WT.Таким образом, снижение вероятности высвобождения синапсов RIM1α KO было спасено ингибированием протеасом. MG132 не оказывал значительного влияния на PPF терминалей WT, что согласуется с нашими структурными результатами, показывающими отсутствие изменений в прикреплении или концентрации проксимальных пузырьков (рис. 2, A и E; и рис. 4). В целом эти данные устанавливают прямую корреляцию между этими структурными особенностями и пресинаптической функцией.

Ингибирование протеасом также индуцировало значительное увеличение доли связанных везикул (P < 0.001 по т тест; Рис. 5 A) и количество соединителей на везикулу (P <0,001 по тесту K-W; рис. 5 C) как в WT, так и в RIM1α KO, что указывает на то, что соединители синаптических везикул регулируются UPS. Диаметр везикул увеличился в синапсах WT и KO, обработанных MG132 (P <0,001 по тесту t в обоих случаях; рис. S3, A и B), что привело к увеличению объема везикул на 37 и 17% соответственно. Эти данные убедительно указывают на то, что UPS регулирует ключевые пресинаптические параметры, такие как размер везикул, распределение везикул и формирование коннекторов и нитей.

RIM1α KO показали уменьшение проксимальных пузырьков в AZ на 40% по сравнению с WT (рис. 2A и рис. 3A), что сопровождалось дефектами прикрепления пузырьков к AZ. Ранее мы предположили, что количество и длина привязок определяют доступность везикул для высвобождения, так что везикулы с множественными короткими привязками структурно подготовлены для слияния (Fernández-Busnadiego et al., 2010).Эта модель согласуется с наблюдениями in vitro, согласно которым механизм слияния точно регулирует межмембранное расстояние и тем самым фузогенность везикул (Li et al., 2007; van den Bogaart et al., 2011). Соответственно, здесь мы показываем, что в синапсах WT расстояние проксимальных пузырьков до AZ было обратно пропорционально количеству привязей (таблица 2). Эта корреляция была потеряна в синапсах RIM1α KO, где дефекты в формировании коротких тросов (рис. 4F) значительно увеличивали среднюю длину троса (рис.4 Д). Следовательно, вполне вероятно, что сильное сокращение проксимальных везикул вместе с дефектами созревания механизма привязывания объясняет снижение вероятности высвобождения и размера RRP в синапсах RIM1α KO (рис. 8; Schoch et al., 2002; Calakos et al.). ., 2004).

В отличие от WT, где все проанализированные синапсы были очень гомогенны с точки зрения распределения пузырьков и организации пресинаптического цитоматрикса, синапсы от мышей RIM1α KO можно было четко разделить на две отдельные категории.Изменения в распределении пузырьков и привязке AZ были относительно мягкими в подгруппе синапсов (выровнены по KO; рис. 2, A и D; и рис. 4). В другой подгруппе (измененный КО) количество проксимальных везикул (рис. 2, А и С; и рис. 3 А) и количество тросов на единицу поверхности АЗ были резко снижены (рис. 4 Г). Кроме того, везикулы полностью не образовывали множественные связи с АЗ (рис. 4С), а образование более коротких филаментов было сильно нарушено в КО-измененных синапсах (рис.4 F и рис. S2). Следовательно, наши данные показывают, что дефекты привязки и организации синаптических везикул были особенно заметны в KO-измененных терминалях, утверждая, что высвобождение, вероятно, сильно снижено в этих синапсах.

Распределение везикул и привязка к AZ в синапсах WT практически не влияли на протеасомный ингибитор MG132 (рис. 2 A, E и рис. 4), в соответствии с предыдущей работой, в которой сообщалось об отсутствии влияния MG132 на RRP (Jiang et al., 2010). Однако мутантные синапсы, обработанные MG132, показали резкое увеличение концентрации везикул в AZ по сравнению с необработанными KO синапсами (рис. 2, A и F). Средняя длина привязи была уменьшена (рис. 4 E) из-за усиленного образования коротких привязок (рис. 4 F), а корреляция между расстоянием везикулы AZ и количеством привязок на везикулу была восстановлена ​​​​до уровней WT (таблица 2), что делает MG132 -обработанные RIM1α KO AZ неотличимы от WT. Следовательно, протеасомное ингибирование восстанавливало структурный фенотип мутантных синапсов.

Важно отметить, что электрофизиологические записи показали, что, хотя MG132 не оказывал значительного влияния на PPF в окончаниях WT, это соединение полностью устраняло снижение вероятности высвобождения, вызванное делецией RIM1α (рис. 8). Таким образом, пресинаптические окончания, неотличимые с точки зрения привязки пузырьков к AZ (WT, обработанные MG132 WT и обработанные MG132 RIM1α KO; рис. S2), имели почти одинаковую вероятность высвобождения, тогда как синапсы с изменениями привязки также были функционально нарушены (RIM1α KO ).Эти данные убедительно подтверждают гипотезу о том, что дефицит высвобождения синапсов RIM1α KO вызван уменьшенным количеством проксимальных везикул и дефектами в формировании привязей. В целом, наши результаты показывают прямое соответствие между структурными и функциональными аспектами высвобождения нейромедиаторов и раскрывают критическую роль механизма привязки в экзоцитозе синаптических пузырьков. Наши данные также предполагают, что модуляция привязки везикул может быть одним из механизмов, с помощью которых UPS регулирует пресинаптическую гомеостатическую пластичность терминально-специфическим образом (Jiang et al., 2010; Лазаревич и др., 2011).

Анализ обширного списка белков показал, что только MUNC13 подавляется в RIM1α KO мозгах (Fig. 6; Schoch et al., 2002, 2006; Kaeser et al., 2008). На самом деле синаптическое рекрутирование и праймирующее действие MUNC13 происходит ниже по течению от RIM (Jiang et al., 2010; Deng et al., 2011). Несмотря на то, что другие белки, которые еще не проанализированы, также могут быть вовлечены, эти данные свидетельствуют о том, что дефекты связывания в RIM1α KO, скорее всего, были результатом отсутствия RIM1α и/или снижения уровней MUNC13, что указывает на то, что RIM1α и/или MUNC13 играют важную роль. роли в формировании привязи.

Дополнительные белки помимо RIM1α должны быть вовлечены в формирование привязи, потому что некоторые привязки сохраняются в синапсах RIM1α KO. RIM1β — единственный синаптический белок, экспрессия которого в RIM1α KO активируется (рис. 6 и рис. S1; это исследование; Kaeser et al., 2008), и его сверхэкспрессия почти полностью восстанавливает дефект праймирования RIM1/2 KO ( Денг и др., 2011). Кроме того, RIM2α и RIM1β являются единственными другими изоформами RIM, содержащими домен цинкового пальца, который взаимодействует с MUNC13 (Mittelstaedt et al., 2010). Следовательно, вероятно, что RIM1β частично компенсирует делецию RIM1α, тогда как участие RIM2α нельзя исключить.

Предыдущие исследования идентифицировали RIM (Yao et al., 2007; Jiang et al., 2010; Lazarevic et al., 2011) и MUNC13 (Aravamudan and Broadie, 2003; Speese et al. , 2003; Kalla et al., 2006; Rinetti and Schweizer, 2010; Tada et al., 2010; Lazarevic et al., 2011) в качестве целей УПС.Инкубация синаптосом WT и RIM1α KO с MG132 сильно снижала активность протеасом в синаптосомах (рис. S4), что приводило к умеренному увеличению уровней RIM1β, RIM2 и MUNC13 в синапсах KO (рис. 6). Мы предполагаем, что такое увеличение позволило сформировать достаточное количество праймирующих комплексов RIM-MUNC13 для восстановления структурного и функционального фенотипа RIM1α KO-синапсов, потому что локально в AZ только небольшое количество молекул (привязок) отличает WT от KO-синапсов. . В таком сценарии способность крио-ЭТ отображать отдельные белковые комплексы, по-видимому, лучше коррелирует с электрофизиологическими измерениями, которые непосредственно оценивают синаптическую функцию (рис.8), чем методы анализа уровней общего белка, такие как вестерн-блоттинг.

Более высокие уровни компенсаторных белков в KO-выровненных, чем в KO-измененных синапсах, могут объяснить более сильные дефекты привязки, наблюдаемые в последней подгруппе. Фактически, несколько линий доказательств указывают на гетерогенные синаптические уровни RIM и MUNC13 в мозге RIM1α KO: (a) RIM имеют перекрывающиеся, но разные паттерны экспрессии (Schoch et al., 2006; Kaeser et al., 2008), и, таким образом, синапсы с более высоким уровнем экспрессии RIM1α и/или более низким уровнем других RIM будут более сильно затронуты делецией RIM1α, (b) доля пресинаптических окончаний, положительных для RIM1 и MUNC13, была изменена в Синаптосомы RIM1α KO (рис. S1), вероятно, потому, что не только уровни, но и распределение RIM1β и MUNC13 изменены в RIM1α KO (Andrews-Zwilling et al., 2006; Kaeser et al., 2008), и (c) уровни компенсаторных RIM в конкретном синапсе RIM1α KO могут находиться под гомеостатическим влиянием его активности (Jiang et al., 2010; Лазаревич и др., 2011).

Наши данные согласуются с предыдущими исследованиями, вовлекающими RIM и MUNC13 в связывание и стыковку синаптических пузырьков. RIM, но не MUNC13, вероятно, участвует в первоначальной ассоциации везикул, опосредованной привязкой, к AZ (рис. 9), поскольку количество везикул в пределах 45 нм от AZ было уменьшено в RIM1α KO (рис. 2 A и рис. 3). А; это исследование) и еще сильнее в КО всех изоформ RIM 1/2 (Han et al., 2011; Kaeser et al., 2011), но не в двойном нокауте MUNC13-1/2 (Siksou et al., 2009). Образование множественных нитей уменьшающейся длины структурно коррелирует с праймированием пузырьков и, вероятно, зависит от SNAREs (Fernández-Busnadiego et al., 2010). Наши результаты предполагают, что RIM1α и, возможно, др. RIM участвуют в переходе между несколькими и множественными связями, возможно, путем образования комплекса с MUNC13 (Fig. 9). В свою очередь, MUNC13, который, как предполагалось, действует как привязь на основании структурного сходства его C-концевого модуля с факторами привязки, может способствовать сборке комплекса SNARE (Li et al., 2011; Ма и др., 2011, 2013). Тем не менее, мы не можем исключить, что дефекты формирования короткой связки в RIM1α KO могут быть вызваны исключительно снижением уровня MUNC13 у этих мышей. Наши данные хорошо согласуются с редукцией пристыкованных везикул, которая, вероятно, лежит в основе дефекта праймирования двойных KO-синапсов MUNC13-1/2 (Siksou et al., 2009), потому что везикулы, которые мы идентифицируем как структурно праймированные, вероятно, соответствуют пристыкованным везикулам в быстрых -замороженные, обезвоженные и окрашенные тяжелыми металлами образцы.В этом препарате мембрана пристыкованных везикул не соприкасалась с AZ напрямую, а через короткие нити, которые были скрыты окрашиванием мембраны (Siksou et al., 2011). Таким образом, во всех быстрозамороженных препаратах, как в синаптосомах, так и в срезах гиппокампа, прямой мембранный контакт между везикулами и АЗ наблюдается только во время экзо/эндоцитоза, а не на стадии докинга. Несмотря на то, что мы не можем уточнить, являются ли RIM или MUNC13 составными элементами привязок или действуют выше по течению от образования привязок, наши результаты предполагают, что RIM участвует в начальной привязке AZ, тогда как структурным коррелятом праймирования везикул является образование множественных привязок уменьшающихся длина, которая, вероятно, зависит от RIM и MUNC13 (рис. 9).

С др. стороны, дополнительные белки, вероятно, участвуют в привязывании AZ. Bruchpilot необходим для закрепления в нервно-мышечном соединении Drosophila melanogaster (Hallermann et al., 2010b), но его гомолог ELKS у млекопитающих имеет другую доменную структуру, и его синаптическая функция неясна (Südhof, 2012). Кроме того, помимо хорошо описанной роли сенсора Ca ²⁺ , синаптотагмин 1 может также действовать как агент стыковки везикул и регулятор расстояния (de Wit et al., 2009; ван ден Богарт и др., 2011). Несмотря на то, что некоторые из этих белков также регулируются UPS (Lazarevic et al., 2011), наши результаты не показали значительных изменений в ELKS, liprins или synaptotagmin1 при ингибировании протеасом (Fig. 6 и Fig. S1). Наконец, у двойных мутантов Piccolo/Fassoon число проксимальных везикул было уменьшено, но синапсическая передача не изменилась, за исключением высокочастотной стимуляции (Hallermann et al. , 2010a; Mukherjee et al., 2010), что свидетельствует против основного вклада этих везикул. белков к структурному и функциональному спасению фенотипа RIM1α KO путем ингибирования протеасом.

Connectors играют фундаментальную роль в кластеризации пузырьков (Fernández-Busnadiego et al., 2010). Связность была выше во всех синапсах RIM1α KO, что приводило к более тесно связанным кластерам пузырьков (Fig. 5). Вместо прямого эффекта RIM1α, локализованного исключительно в AZ (Tao-Cheng, 2006; Dani et al., 2010), это указывает на то, что дефекты в архитектуре AZ распространяются в изменения цитоматрикса по всей терминальной части.

Ингибирование протеасом вызывает очень значительное увеличение связности везикул в синапсах WT и KO (Fig. 5), что указывает на то, что связность и, следовательно, кластеризация пузырьков регулируются UPS. В самом простом сценарии коннекторы могут разрушаться протеасомой, и, таким образом, их количество увеличивается при ингибировании протеасомы. Интересно, что молекулярные кандидаты для образования соединителей, такие как синапсин (Hirokawa et al., 1989), как сообщается, являются мишенями протеасомной деградации (Fioravante et al., 2008; Lazarevic et al., 2011). Тем не менее, точные роли синапсинов остаются неясными, т.к. некоторые коннекторы сохраняются у мышей с тройным нокаутом синапсинов (Siksou et al., 2007).

Несмотря на то, что PPF и вероятность высвобождения имеют обратную корреляцию, механистическая связь между ними изучена недостаточно. Наши данные показывают, что уменьшенное количество проксимальных везикул и дефектов привязки лежат в основе снижения вероятности высвобождения в синапсах RIM1α KO, и предполагают, что соответствующее увеличение PPF (рис.8; Шох и др., 2002; Calakos et al., 2004) может быть вызван перекрестным взаимодействием между привязкой и подключением, что также может пролить свет на судьбу коннекторов при высвобождении везикул. А именно, в RIM1α KO, в котором одна подгруппа синапсов имеет сильно уменьшенное высвобождение (KO изменен), можно ожидать, что протокол PPF предпочтительно выбирает подгруппу с более высокой вероятностью высвобождения (KO выровнен). Заманчиво предположить, что структурным коррелятом повышенного PPF в RIM1α KO может быть большая доля связанных и связанных везикул, которые доминируют в проксимальной зоне в KO-выровненных терминалях (рис.5D и рис. S2), возможно, из-за недостаточной компенсации другими RIM. В этом сценарии высвобождение одного из этих пузырьков притянет связанных с ним партнеров к АЗ в положение, в котором его можно будет легко высвободить при втором стимуле, что приведет к облегчению.

Увеличение диаметра везикул во всех синапсах KO (рис. S3) является еще одним проявлением изменений за пределами AZ, вызванных отсутствием RIM1α.Ингибирование протеасом вызывало значительное увеличение диаметра везикул как в WT, так и в KO терминалях, указывая на то, что механизмы контроля размера везикул также зависят от UPS. Это явление можно объяснить несколькими сценариями, от накопления недеградированных белков на мембране везикул до изменений в эндоцитарном аппарате, ведущих к нарушению биогенеза везикул (Edwards, 2007). Таким образом, наши результаты не только обеспечивают структурный механизм дефектов высвобождения, наблюдаемых в RIM1α KO терминалях, но они также подчеркивают важность механизма привязки в экзоцитозе везикул и указывают на UPS как на новый регулятор пресинаптической архитектуры.

мышей RIM1α ^-/- были получены на фоне гибрида SV129/Bl6 и подвергнуты по крайней мере четырем обратным скрещиваниям с c57/Bl6 (Schoch et al., 2002). Цереброкортикальные синаптосомы были извлечены из самцов мышей RIM1α ^+/+ и RIM1α ^-/- в возрасте 6–8 недель, как описано ранее Dunkley et al. (1988) и Godino et al. (2007) и в соответствии с процедурами, принятыми Институтом биохимии им. Макса Планка.Вкратце, умерщвленных животных декапитировали, а кору головного мозга извлекали и гомогенизировали в гомогенизирующем буфере (HB; 0,32 М сахарозы и 50 мМ ЭДТА, pH 7,4) до семи ударов при 700 об/мин в гомогенизаторе из тефлонового стекла. Гомогенат центрифугировали 2 мин при 2000 g , осадок ресуспендировали в HB и центрифугировали еще 2 мин при 2000 g . Супернатанты от обоих центрифугирований объединяли и центрифугировали в течение 12 мин при 9500 g .Осадок ресуспендировали в HB и загружали в трехступенчатый (3, 10 и 23%) градиент Percoll (GE Healthcare) в HB. Градиенты вращали в течение 6 минут при 25 000 г , и материал, накопленный на границе раздела 10/23%, извлекали и разбавляли до конечного объема 50 мл в Hepes-буферной среде (HBM; мМ: 140 NaCl, 5 KCl). , 5 NaHCO ₃ , 1,2 Na ₂ HPO ₄ , 1 MgCl ₂ , 10 глюкоза и 10 Hepes, pH 7,4). Перколл удаляли центрифугированием в течение 10 мин при 22 000 g и осадок ресуспендировали в HBM с добавлением 1. 2 мМ CaCl ₂ и сразу использовали в опытах. Все стадии проводили при 4°C. Ингибиторы протеазы не использовались при подготовке синаптосом.

разводили до концентрации белка ~1 мг/мл, определенной с помощью анализа Бредфорда (Bio-Rad Laboratories), и предварительно инкубировали в течение 30 мин при 37°C. Перед витрификацией синаптосомы инкубировали еще 30 мин при 37°С: без добавок, с 10 мкМ MG132 (карбобензоил-1-лейцил-1-лейцил-1-лейциналь; Enzo Life Sciences), разведенным в ДМСО или с эквивалентным количеством ДМСО.Анализы протеасомной активности и вестерн-блоттинг проводили только в синаптосомах, обработанных ДМСО и MG132. Томограммы необработанных и обработанных ДМСО синаптосом не выявили существенных различий и были объединены в качестве контрольной категории. Для дальнейшего анализа отбирали только томограммы синаптосом, содержащих митохондрии, чтобы убедиться в их жизнеспособности (Harrison et al. , 1988).

Каплю 3 мкл коллоидного золота, покрытого 10-нанометровым БСА, растворенного в PBS (Aurion), наносили на очищенные плазмой медно-дырчатые ЭМ сетки (Quantifoil) и давали высохнуть.Каплю 3 мкл суспензии синаптосом помещали на сетку, давали ей уравновеситься в течение 5 с, промокали фильтровальной бумагой (Whatman Grade 1) и погружали в жидкую смесь этан/пропан. Перед визуализацией витрифицированные сетки хранили в жидком азоте. Существенной диффузии растворенных веществ из высушенного раствора золота в синаптосомальную суспензию не происходило, так как концентрация Na ⁺ повышалась до 160 ± 20 мМ (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 9), когда капля объемом 3 мкл, содержащая 140 мМ NaCl добавляли к сеткам, в которых раствор золота был предварительно высушен, и до 151 ± 2 мМ (среднее ± стандартное отклонение, n = 9) при использовании сеток без высушенного раствора золота (контроль). В обоих случаях добавленным каплям давали уравновеситься на сетках в течение 30 с. Концентрацию Na ⁺ определяли, добавляя 10 мкМ CoroNa Green (Invitrogen) и контролируя флуоресценцию на флуороспектрометре (NanoDrop 3300; Thermo Fisher Scientific).

Синаптосомы мышей WT и RIM1α KO обрабатывали ДМСО или MG132, смешивали с 5-кратным буфером для образцов SDS и кипятили. Образцы подвергали гель-электрофорезу с использованием геля NuPAGE 4–12% Bis-Tris в подвижном буфере MES SDS с последующим иммуноблоттингом.Мышиные антитела против RIM1 (610907) и MUNC13 (610999) были приобретены у BD, Rab3 (107011), синтаксин1 (110011), SNAP25 (111002), VAMP2 (104211) и ELKS (143003) были приобретены у Synaptic Systems, synaptotagmin1 ( 136088) и убиквитин (8017) были получены от Santa Cruz Biotechnology, Inc., α-тубулин (T6199) был получен от Sigma-Aldrich, RIM2 был подарен F. Schmitz (Университет Саарланда, Хомберг, Германия), а Liprin2 и Liprin3 получали, как описано ранее Zürner et al. (2011). Экспрессию белка определяли с помощью анализатора люминесцентных изображений (LAS-3000) и программного обеспечения Image Reader LAS-3000 (Leica). Размер выборки составил 13 пар однопометников WT и RIM1α KO.

Синаптосомы мышей WT и RIM1α KO обрабатывали ДМСО или MG132 и обрабатывали, как описано ранее (Martín et al., 2007). Вкратце, синаптосомы высевали на покровные стекла, покрытые поли-1-лизином, и оставляли прикрепляться на 30 минут с последующей 30-минутной инкубацией с ДМСО или MG132.Синаптосомы фиксировали в течение 5 мин в PBS, содержащем 4% параформальдегида, и блокировали PBS, содержащим 1% BSA, 10% нормальной козьей сыворотки и 0,1% Triton X-100. После нескольких отмывок синаптосомы инкубировали с первичными антителами в течение 12–14 ч (антитела к RIM1 и RIM2 были подарены F. Schmitz, антитела MUNC13 [126102], VAMP2 [104211] и ELKS [143003] были приобретены у Synaptic Systems. ; и антитело Bassoon [SAP7F407] было приобретено у Enzo Life Sciences). Синаптосомы промывали и дополнительно инкубировали со вторичными антителами в течение 40 минут при комнатной температуре (козьи антимышиные FITC и козьи антикроличьи Cy3 были приобретены у Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Покровные стекла тщательно промывали в PBS и заключали в Mowiol (Sigma-Aldrich). Изображения были получены при комнатной температуре в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе (A1; Nikon) с использованием иммерсионного инфракрасного объектива CFI Plan Apochromat 60× (NA 1,27) и программного обеспечения для сбора данных NIS-Elements 4.0 (Nikon). Фракция окрашивания белка AZ (ELKS, MUNC13, RIM1 и RIM2), совместно локализующаяся с окрашиванием пресинаптических маркеров (VAMP2 и Фагот), была количественно определена с использованием пороговых коэффициентов Мандерса, реализованных в плагине JACoP (Bolte and Cordelières, 2006) ImageJ (National Институты здоровья; Schneider et al., 2012). Размер выборки составлял пять пар однопометников WT и RIM1α KO, по 15–20 изображений на состояние.

Синаптические ответы регистрировали на срезах гиппокампа (400 мкм) мышей в возрасте 2–3 недель при комнатной температуре с помощью потенциалов внеклеточного поля (вВПСП) в лучистом слое в СА1. Срезы хранили и регистрировали в искусственной спинномозговой жидкости (ИЦЖ), содержащей следующее (мМ): 130 NaCl, 2.75 KCL, 1,5 МГСО ₄ , 2.5 CaCl ₂ , 1.1 Nahpo ₄ , 28,82 NaHCO ₃ и 11 глюкоза, насыщенные 95% O ₂ и 5% CO ₂ , pH 7.4. Подмножество срезов предварительно инкубировали в ACSF, содержащем 10 мкМ MG132, в течение 1–2 часов. Пипетки для записи и стимуляции заполняли ACSF. Коллатерали Шаффера стимулировали с частотой 0,1 Гц и измеряли начальные наклоны пВПСП. ППФ вызывали вторым стимулом через 40 мс после первого стимула. Все данные были получены для однопометных потомков от гетерозиготных скрещиваний и проанализированы без знания генотипа изучаемой ткани. Размеры выборки (срезы/животные) следующие: WT, 14/4; WT + MG132, 16/4; RIM1α КО, 14/4; и RIM1α KO + MG132, 13/4.

Tilt была собрана по схеме сбора данных с низкой дозой с использованием электронного микроскопа (Polara; FEI), работающего при напряжении 300 кВ. Микроскоп был оснащен автоэмиссионной пушкой, приборной камерой с зарядовой связью 2048 × 2048 (MultiScan; Gatan), постколоночным энергетическим фильтром (Gatan), работающим в режиме нулевых потерь, и компьютеризированным криостолом, предназначенным для поддержания температуры образца. ниже -150°С.Серии наклонов были записаны с использованием Xplore3D (FEI), обычно от -60° до 60° с угловым приращением 2°. Размер пикселя составлял 0,66 нм на уровне образца, а расфокусировка была установлена ​​на -9 мкм. Суммарная доза не превышала 150 e ^— /Å ² .

Tilt была выровнена с использованием золотых шариков в качестве реперных маркеров, а 3D-реконструкции были получены с помощью взвешенной обратной проекции с аналитическим взвешиванием с использованием набора инструментов TOM (Nickell et al. , 2005). Во время реконструкции проекции дважды группировались (конечный размер вокселя 2,64 нм) и подвергались низкочастотной фильтрации на частоте Найквиста после группирования, таким образом ограничивая номинальное разрешение томограмм размерами вокселя. Впоследствии томограммы были очищены от шума с помощью анизотропной нелинейной диффузионной фильтрации (Fernández and Li, 2003). Томографические изображения толщиной 5,4 нм, показанные на рис. 1 и рис. 7, были сформированы путем сложения двух последовательных срезов толщиной 2,64 нм. Томографические срезы отображаются с помощью инструмента интерполяции IMOD (Kremer et al., 1996).

Для анализа связности, привязывания, диаметра и распределения пузырьков значения, рассчитанные для каждой категории образцов, были объединены и подвергнуты статистическому анализу. Количество пузырьков, соединителей и тросов, проанализированных для каждой категории, показано в таблице S1. Средние значения рассчитывались по всем измерениям конкретного свойства. Мы использовали тест t для статистического анализа значений, которые оказались нормально распределенными (т.g., диаметр везикулы) и критерий K-W (непараметрический) для значений, отклоняющихся от нормального распределения (например, количество тросов/соединителей на везикулу). Когда значения попадали в дискретные ячейки (например, доля связанных и несвязанных везикул), использовался критерий χ ² . Для корреляционного анализа использовали коэффициент Пирсона, а его значимость определяли с помощью теста t . Во всех случаях уровни достоверности рассчитывались с использованием двусторонних критериев. Значения достоверности отмечены на графиках одной звездочкой для P < 0.05, двойная звездочка для P <0,01 и тройная звездочка для P <0,001.

На рис. S1 показаны синаптосомы, иммуноокрашенные для различных пресинаптических белков. На рис. S2 показана полуколичественная сводка данных о привязке, соединении и размере пузырьков для проксимальных пузырьков. На рис. S3 показан диаметр синаптических пузырьков для пузырьков в пределах 250 нм от AZ. На рис. S4 показана протеасомная химотриптическая активность в синаптосомах.В таблице S1 суммировано количество животных, синапсов, синаптических пузырьков, соединителей и привязей, проанализированных для каждой категории. Видео 1, Видео 2 и Видео 3 показывают томограммы и соответствующие 3D-изображения синапсов WT, RIM1α KO-измененных и RIM1α KO-выровненных соответственно. Также предоставляется ZIP-файл, содержащий код, который использовался для статистического анализа результатов сегментации и построения всех графиков, показанных в этой статье.

Пузыри и пустулы у новорожденных

Авторы: Джессика Чен, студент-медик, Университет Нового Южного Уэльса, Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия; Доктор Анес Янг, научный сотрудник в области дерматологии, ведущий специалист, больница Святого Георгия, Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия. Главный редактор DermNet NZ: адъюнкт А/проф. Аманда Окли, дерматолог, Гамильтон, Новая Зеландия. Копия отредактирована Гасом Митчелл/Марией МакГиверн. Июнь 2019.

Введение и определения

На этой странице описаны везикулобуллезные и пустулезные поражения у новорожденных и их отличительные характеристики.

• Новорожденный – это новорожденный в возрасте до 28 дней.
• Везикулы представляют собой небольшие волдыри, содержащие прозрачную жидкость.
• Буллы представляют собой большие волдыри, содержащие прозрачную жидкость.
• Пустулы представляют собой очерченные поражения, содержащие плотное клеточное содержимое.

Везикулобуллезные и пустулезные поражения у новорожденных могут быть вызваны различными доброкачественными состояниями, инфекцией, генодерматозом или транзиторным аутоиммунным буллезным заболеванием.

Заполненные жидкостью поражения кожи

Доброкачественные заболевания, вызывающие волдыри и пустулы у новорожденных

Существует несколько доброкачественных заболеваний, которые могут проявиться в течение нескольких дней после рождения в виде волдырей и пустул. К ним относятся:

• Врожденные сосательные волдыри — волдыри и эрозии на предплечье, кистях и пальцах, вызванные энергичным сосанием плода в утробе матери
• Токсическая эритема новорожденных — временное сочетание эритематозных пятен, папул и пустул на лице, туловище и конечностях
• Транзиторный пустулезный меланоз новорожденных — редкое пустулезное состояние может быть вариантом токсической эритемы новорожденных
• Акне новорожденных — проявляется комедонами на коже головы, верхней части грудной клетки и спины и воспалительными поражениями на щеках, подбородке и лбу.

Доброкачественные состояния новорожденных

Волдыри у новорожденных могут быть вызваны вирусной, бактериальной, грибковой или паразитарной инфекцией.

Вирусная инфекция

Вирусная инфекция начинается в течение нескольких дней или недель после рождения.

• ВПГ и ВВО представляют собой сгруппированные пузырьки на эритематозном основании, которые развиваются в пустулы, а затем в эрозии с корками.
• Локализованные волдыри, вызванные простым герпесом, часто обнаруживаются на лице и волосистой части головы, а иногда на туловище и ягодицах.У новорожденных может развиться диссеминированный ВПГ.
• ВПГ может быть связан с недоношенностью и низкой массой тела при рождении и может осложнять другие везикуло-пустулезные заболевания.
• Первичная инфекция ветряной оспы у новорожденных (ветряная оспа) имеет высокий уровень смертности 25%.

Вирусные инфекции, вызывающие волдыри

Бактериальная инфекция

Стафилококковая инфекция у новорожденных обычно проявляется локализованными поверхностными, дряблыми, везикулобуллезными или пустулезными поражениями, которые вскрываются с образованием эритематозного основания, а затем образуют серозно-гнойные корочки.Инфекция может распространяться, вызывая лихорадку и широкое распространение СССО [1].

Листериоз является причиной преждевременных родов. Он проявляется рано множественными пустулами на слизистых оболочках и коже и может прогрессировать, вызывая менингит и септицемию [1].

Врожденный сифилис связан с генерализованными геморрагическими буллами и петехиями.

Стафилококковые инфекции у новорожденных

Грибковая инфекция

Инфекция, вызванная Candida albicans , как правило, развивается через несколько недель после рождения или у детей старшего возраста и часто проявляется в виде кандидозного стоматита (белые липкие бляшки на покрасневшей слизистой оболочке) или пеленочного дерматита.Кандидозные инфекции характеризуются очень поверхностными волдырями и пустулами, связанными с эритематозными папулами и бляшками в интертригинозных участках. Системный микоз с диссеминированным кандидозом может встречаться и у новорожденных [1].

Оральная инфекция Candida albicans

Паразитарная инфекция

Чесотка, вызываемая паразитическим клещом Sarcoptes scabiei . У маленьких детей он вызывает распространенную везикуло-пустулезную сыпь, которая проявляется на ладонях и подошвах. Источником заражения может быть член семьи или гость с зудящей сыпью [1].

Чесотка у младенца

Пузырчатые генодерматозы у новорожденных

Пузырчатые генодерматозы:

Наследственные везикулопустулезные и буллезные генодерматозы встречаются редко. Их следует заподозрить у новорожденных с семейным анамнезом генодерматоза или кровного родства [2].

• Клинический диагноз буллезного эпидермолиза может быть недостоверным из-за вариабельности клинических проявлений.Буллезный эпидермолиз связан с общей ломкостью кожи и образованием пузырей после незначительной травмы и имеет внекожные проявления [2].
• Эпидермолитический ихтиоз — это кератинопатия, которая проявляется распространенными волдырями и шелушением. Локализованный вариант вызывает эпидермальный невус [1].
• Врожденная аплазия кожи представляет собой врожденное очаговое отсутствие кожи, чаще всего изолированное поражение средней линии задней поверхности скальпа. Иногда это связано с другими физическими недостатками или нарушениями [1].
• Пигментная недержание мочи проявляется вдоль линий Блашко (например, в виде линейной сыпи на одной конечности). Он имеет четыре стадии развития (везикулярную, бородавчатую, гиперпигментированную и атрофическую/гипопигментированную), которые могут присутствовать одновременно; образование пузырей встречается в 50% случаев [1].

Генодерматозы, которые могут образовывать волдыри

Образование пузырей вследствие преходящих аутоиммунных заболеваний у новорожденных

Аутоиммунное образование пузырей у матери в анамнезе может привести к возникновению у новорожденного такого же аутоиммунного буллезного заболевания.Аутоиммунные буллезные заболевания, передающиеся от матери, обычно проходят в течение нескольких месяцев после рождения [1]. К ним относятся:

Какие анализы следует провести новорожденному с волдырями?

Первичное обследование новорожденных с волдырями включает соскоб жидкости и клеток из неповрежденного волдыря для вирусной/бактериальной/грибковой микроскопии, посева и тестирования полимеразной цепной реакции на специфические микроорганизмы [1,2].

Биопсия кожи с прямой иммунофлуоресценцией или без нее должна быть проведена, если инфекционный скрининг отрицательный и у пациентов, невосприимчивых к начальной терапии [3].

Посев крови, мочи и спинномозговой жидкости можно использовать для выявления диссеминированного заболевания при ССС и простом герпесе [1].

Генодерматозы могут быть подтверждены биопсией кожи с использованием стандартной световой микроскопии, просвечивающей электронной микроскопии и иммунофлуоресцентной микроскопии. Молекулярно-генетическое тестирование также следует рассмотреть [2].

Аутоиммунное пузырное заболевание исследуют с помощью образца пуповинной крови с непрямой иммунофлуоресценцией сыворотки на солевой расщепленной коже и иммуноферментным анализом аутоантител к десмоглеину 1 и 3 и антигену буллезного пемфигоида ВР180.Если в анамнезе у матери нет волдырей, следует выполнить биопсию пораженной кожи для гистопатологии. Биопсия кожи вокруг поражений должна быть представлена ​​для прямой иммунофлуоресценции [2,4].

Что такое лечение волдырей у новорожденных?

Лечение волдырей зависит от диагноза.

Доброкачественные заболевания, такие как акне новорожденных, токсическая эритема новорожденных и транзиторный пустулезный меланоз новорожденных, проходят самостоятельно и не требуют специального лечения [1].

Бактериальную инфекцию следует лечить с помощью эмпирических антибиотиков в соответствии с рекомендациями каждой страны.

Лечение буллезного эпидермолиза сосредоточено на профилактике, лечении ран и оптимизации питания [2]. Врожденная аплазия кожи обычно лечится консервативным лечением раны.

Большинство случаев неонатальной аутоиммунной пузырчатой ​​болезни самоизлечиваются, и симптомы могут быть уменьшены с помощью местных кортикостероидов [3].

Спортивная стопа | Мичиган Медицина

Обзор темы

Что такое эпидермофития стопы?

Эпидермофития стопы – сыпь на коже стопы.Это самая распространенная грибковая инфекция кожи. Выделяют три основных типа микоза стопы. Каждый тип поражает разные части стопы и может выглядеть по-разному.

Что вызывает эпидермофитию стоп?

Эпидермофития стопы вызывается грибком, который растет на верхнем слое кожи или в нем. Грибы (множественное число от грибка) лучше всего растут в теплых, влажных местах, например, в области между пальцами ног.

Эпидермофития стопы легко расправляется. Вы можете получить его, коснувшись пальцев ног или ступней человека, у которого он есть.Но чаще всего люди заражаются при ходьбе босиком по загрязненным поверхностям возле бассейнов или в раздевалках. Затем грибки разрастаются в вашей обуви, особенно если она настолько тесная, что воздух не может проходить вокруг ваших ног.

Если вы прикоснетесь к предмету, на котором есть грибки, вы можете заразить микозом других людей, даже если вы сами не заразитесь. Некоторые люди более склонны к микозу стопы, чем другие. Эксперты не знают, почему это так. После того, как у вас была микоз, у вас больше шансов заболеть им снова.

Каковы симптомы?

Эпидермофития стопы может вызвать жжение и зуд в ступнях и коже между пальцами ног. Кожа может шелушиться и трескаться. Ваши симптомы могут зависеть от типа микоза стопы.

• Инфекция перепонки пальца ноги обычно возникает между четвертым и пятым пальцами. Кожа становится шелушащейся, шелушится и трескается. У некоторых людей также может быть бактериальная инфекция. Это может привести к еще большему разрушению кожи.
• Инфекция мокасинового типа может начаться с небольшой болезненности на ноге. Тогда кожа на подошве или пятке стопы может утолщаться и трескаться. В тяжелых случаях ногти на ногах инфицируются и могут утолщаться, крошиться и даже выпадать. Грибковое поражение ногтей на ногах требует отдельного лечения.
• Инфекция везикулярного типа обычно начинается с внезапного появления под кожей пузырьков, наполненных жидкостью. Волдыри обычно находятся на нижней части стопы. Но они могут появиться где угодно на вашей ноге. Вы также можете заразиться бактериальной инфекцией при этом типе микоза.

Как диагностируется эпидермофития стопы?

В большинстве случаев врач может сказать, что у вас микоз стопы, посмотрев на ваши стопы. Он или она также спросит о ваших симптомах и любых прошлых грибковых инфекциях, которые у вас могли быть. Если микоз стопы выглядит необычно или если ранее лечение не помогало, врач может взять образец кожи или ногтя для проверки на наличие грибков.

Не все проблемы с кожей на стопе связаны с микозом. Если вы подозреваете, что у вас микоз стопы, но никогда раньше этого не было, рекомендуется обратиться к врачу.

Как лечится?

В большинстве случаев эпидермофитию стопы можно лечить дома с помощью безрецептурного лосьона, крема или спрея. В тяжелых случаях врач может выписать вам рецепт на таблетки или лекарства, которые вы наносите на кожу. Используйте лекарство до тех пор, пока ваш врач говорит вам. Это поможет убедиться, что вы избавитесь от инфекции.Также нужно держать ноги в чистоте и сухости. Грибы нуждаются в влажных, теплых местах, чтобы расти.

Вы можете сделать некоторые вещи, чтобы не заболеть микозом стопы снова. Носите сандалии для душа в местах общего пользования, таких как раздевалки, и используйте тальк, чтобы ваши ноги оставались сухими. Носите сандалии или просторную обувь из материалов, пропускающих влагу.

Причина

Эпидермофития стопы (дерматомикоз стопы) представляет собой грибковую инфекцию кожи стопы. Вы получаете микоз, когда контактируете с грибком, и он начинает расти на вашей коже.

Грибы обычно растут на верхнем слое кожи человека или в нем и могут вызывать или не вызывать инфекции. Грибки лучше всего растут в теплых, влажных местах, например, между пальцами ног.

Эпидермофития легко распространяется (заразна). Вы можете получить его, прикоснувшись к пораженному участку человека, у которого он есть. Чаще всего вы подхватываете грибки с влажных загрязненных поверхностей, таких как полы в общественных душевых или раздевалках.

Хотя эпидермофития стопы заразна, некоторые люди более склонны к ней (восприимчивы), чем другие.Восприимчивость может увеличиваться с возрастом. Эксперты не знают, почему некоторые люди более склонны к этому заболеванию. После того, как у вас была микоз, у вас больше шансов заболеть им снова.

Если вы контактируете с грибками, вызывающими микоз, вы можете заразить других, независимо от того, заразились ли вы инфекцией или нет.

Симптомы

Эпидермофития стоп (дерматомикоз стопы) Симптомы варьируются от человека к человеку. Хотя некоторые люди испытывают сильный дискомфорт, у других симптомы незначительны или отсутствуют вовсе.Общие симптомы включают:

• Шелушение, растрескивание и шелушение стоп.
• Покраснение, волдыри или размягчение и разрушение (мацерация) кожи.
• Зуд, жжение или и то, и другое.

Инфекция перепонки пальца

Инфекция перепонки пальца (межпальцевая) является наиболее распространенным типом микоза стопы. Обычно это происходит между двумя самыми маленькими пальцами ног. Этот тип инфекции:

• Часто начинается с кожи, которая кажется мягкой, влажной и бледно-белой.
• Может вызывать зуд, жжение и слабый запах.
• Может стать хуже. Кожа между пальцами ног шелушится, шелушится и трескается. Если инфекция становится тяжелой, обычно присутствует бактериальная инфекция, которая вызывает дальнейшее разрушение кожи и неприятный запах.

Мокасиновая инфекция

Мокасиновая инфекция представляет собой продолжительную (хроническую) инфекцию. Этот тип инфекции:

• Может начинаться с незначительного раздражения, сухости, зуда, жжения или шелушения кожи.
• Прогрессирует до утолщения, шелушения, растрескивания и шелушения кожи на подошве или пятке. В тяжелых случаях ногти на ногах инфицируются и могут утолщаться, крошиться и даже выпадать. Для получения дополнительной информации см. тему Грибковые инфекции ногтей.
• Может появиться на ладони (симптомы обычно поражают одну руку и обе ноги).

Везикулярная инфекция

Везикулярная инфекция является наименее распространенным типом инфекции. Этот тип:

• Обычно начинается с внезапного появления под кожей пузырьков, наполненных жидкостью.Волдыри чаще всего появляются на коже подъема стопы, но могут также образовываться между пальцами ног, на пятке, подошве или верхней части стопы.
• Иногда возникает снова после первого заражения. Инфекции могут возникать в той же области или в другой области, например, на руках, груди или пальцах. У вас может быть шелушение кожи между высыпаниями.
• Может также сопровождаться бактериальной инфекцией.

Эпидермофитию стопы иногда путают с ямчатым кератолизом. При этой проблеме со здоровьем кожа выглядит как «влажные соты».» Чаще всего это происходит там, где стопа несет вес, например, на пятке и подушечке стопы. Симптомы включают сильное потоотделение ног и неприятный запах.

Что происходит

Как развивается эпидермофития стопы (дерматофития стоп) и насколько хорошо она поддается лечению, зависит от типа эпидермофитии стопы.

Инфекция перепонки пальца ноги

Инфекция перепонки пальца ноги (межпальцевая) часто начинается с кожи, которая кажется влажной и бледно-белой. Вы можете заметить зуд, жжение и легкий запах.По мере обострения инфекции кожа между пальцами ног становится чешуйчатой, шелушится и трескается. Если грибковая инфекция становится тяжелой, также может развиться бактериальная инфекция. Это может привести к дальнейшему разрушению кожи. Бактериальная инфекция может также поразить голень (флегмона голени). Инфекции перепонок пальцев ног часто приводят к внезапной везикулярной (пузырьковой) инфекции.

Инфекции перепонок пальцев ног хорошо поддаются лечению.

Инфекция мокасинового типа

Инфекция мокасинового типа может начинаться с незначительного раздражения, сухости, зуда, жжения или шелушения кожи и прогрессировать до утолщения, трещин кожи на подошве или пятке. В тяжелых случаях ногти на ногах инфицируются и могут утолщаться, крошиться и даже выпадать. Если не принимать профилактических мер, эта инфекция часто возвращается. У вас также может развиться инфекция на ладони (симптомы обычно поражают одну руку и обе ноги).

Мокасиновые инфекции могут быть длительными.

Везикулярная инфекция

Везикулярная инфекция (волдыри) обычно начинается с внезапного появления волдырей, которые становятся красными и воспаленными. Волдыри иногда появляются снова после первой инфекции.Также может присутствовать бактериальная инфекция. Везикулезная инфекция часто развивается из-за длительной инфекции перепонки пальца ноги. Волдыри также могут появиться на ладонях, боковой стороне пальцев и других участках (дерматофитидная или id-реакция).

Везикулярные инфекции обычно хорошо поддаются лечению.

Осложнения

При отсутствии лечения волдыри и трещины на коже, вызванные эпидермофитией стопы, могут привести к тяжелым бактериальным инфекциям. При некоторых типах эпидермофитии ногти на ногах могут быть инфицированы.Для получения дополнительной информации см. тему Грибковые инфекции ногтей.

Все виды микоза стопы можно лечить, но после лечения симптомы часто возвращаются. Эпидермофития стоп скорее всего вернется, если:

• Вы не принимаете профилактические меры и снова подвергаетесь воздействию грибков, вызывающих эпидермофитию стоп.
• Вы не используете противогрибковые препараты в течение предписанного периода времени, и грибки не полностью уничтожены.
• Грибки не погибают полностью даже после полного курса лечения.

Тяжелые инфекции, которые появляются внезапно и продолжают возвращаться, могут привести к длительной инфекции.

Что увеличивает риск

Эпидермофития легко распространяется (заразна). Вы можете получить его, прикоснувшись к пораженному участку человека, у которого он есть. Чаще всего вы подхватываете грибки с влажных загрязненных поверхностей, таких как полы в общественных душевых или раздевалках.

Эпидермофития стопы заразна, но некоторые люди более склонны к ней (восприимчивы), чем другие.Восприимчивость может увеличиваться с возрастом. Эксперты не знают, почему некоторые люди более склонны к этому заболеванию. После того, как у вас была микоз, у вас больше шансов заболеть им снова.

Если вы не подвержены микозу стопы, вы можете контактировать с грибками, вызывающими микоз, но не заразиться. Но вы все равно можете заразить других.

Факторы риска, которые вы не можете изменить

Факторы риска, которые вы не можете изменить, включают:

• Быть мужчиной.Мужчины более восприимчивы, чем женщины.
• Предрасположенность к грибковым инфекциям.
• Имеющие ослабленную иммунную систему (из-за таких состояний, как диабет или рак).
• Проживание в теплом влажном климате.
• Старение. Эпидермофития стоп чаще встречается у пожилых людей. У детей это редко получается.

Факторы риска, которые вы можете изменить

Факторы риска, которые вы можете изменить, включают:

• Оставлять ноги влажными.
• Ношение тесной, плохо вентилируемой обуви.
• Использование общественных или общих душевых или раздевалок без обуви для душа.
• Действия, связанные с длительным пребыванием в воде.

Когда следует звонить врачу?

Позвоните своему врачу по поводу кожной инфекции на ногах, если:

• У вас сильно растрескивается, шелушится или шелушится кожа на ногах.
• У вас волдыри на ногах.
• Вы заметили признаки бактериальной инфекции, в том числе:
  • Усиление боли, отек, покраснение, болезненность или жар.
  • Красные полосы, отходящие от пораженного участка.
  • Выделение гноя.
  • Лихорадка 100,4°F (38°C) или выше без какой-либо другой причины.
• Похоже, инфекция распространяется.
• У вас диабет или заболевания, связанные с плохим кровообращением, и вы заболели микозом. Люди, страдающие диабетом, подвержены повышенному риску тяжелой бактериальной инфекции стопы и голени, если у них микоз.
• Ваши симптомы не улучшаются после 2 недель лечения или не исчезают после 4 недель лечения безрецептурным противогрибковым препаратом.

Настороженное ожидание

Настороженное ожидание — это период времени, в течение которого вы и ваш врач наблюдаете за вашими симптомами или состоянием без медицинского лечения. Обычно вы можете лечить микоз стопы самостоятельно в домашних условиях. Но любые стойкие, тяжелые или рецидивирующие инфекции должны быть оценены вашим врачом.

При появлении симптомов микоза стопы вы можете сначала использовать безрецептурный продукт. Если ваши симптомы не улучшаются после 2 недель лечения или не исчезают после 4 недель лечения, позвоните своему врачу.

К кому обратиться

Медицинские работники, которые могут диагностировать или лечить эпидермофитию стопы, включают:

Обследования и анализы

В большинстве случаев врач может диагностировать эпидермофитию стопы (микоз стопы), осмотрев вашу стопу. Он или она также спросит о ваших симптомах и любых предыдущих грибковых инфекциях, которые у вас были.

Если ваши симптомы выглядят необычными или если предыдущая инфекция плохо поддавалась лечению, ваш врач может взять образец кожи или ногтя, слегка поцарапав кожу лезвием или краем предметного стекла или обрезав ноготь. Он или она исследует образцы кожи и ногтей с помощью лабораторных анализов, включая:

В редких случаях будет сделана биопсия кожи путем удаления небольшого кусочка кожи, который будет изучен под микроскопом.

Обзор лечения

Способ лечения эпидермофитии стоп (дерматомикоза стопы) зависит от его типа и степени тяжести.В большинстве случаев эпидермофитию стопы можно лечить в домашних условиях с помощью противогрибковых препаратов, которые убивают грибок или замедляют его рост.

• Противогрибковые препараты, отпускаемые без рецепта, обычно используются в первую очередь. К ним относятся клотримазол (лотримин), миконазол (микатин), тербинафин (ламизил) и толнафтат (тинактин). На кожу наносят безрецептурные противогрибковые препараты (лекарства для местного применения).
• Противогрибковые препараты, отпускаемые по рецепту, можно попробовать, если лекарства, отпускаемые без рецепта, не эффективны или если у вас тяжелая инфекция.Некоторые из этих лекарств являются местными противогрибковыми средствами, которые наносятся непосредственно на кожу. Примеры включают бутенафин (Ментакс), клотримазол и нафтифин (Нафтин). Противогрибковые препараты, отпускаемые по рецепту, также можно принимать в виде таблеток, которые называются пероральными противогрибковыми препаратами. Примеры пероральных противогрибковых препаратов включают флуконазол (Дифлюкан), итраконазол (Споранокс) и тербинафин (Ламизил).

При тяжелом микозе стопы, который не проходит, врач может прописать пероральные противогрибковые препараты (таблетки). Пероральные противогрибковые таблетки используются только в тяжелых случаях, поскольку они дороги и требуют периодической проверки на опасные побочные эффекты. Эпидермофития стопы может вернуться даже после лечения противогрибковыми таблетками.

Даже если симптомы улучшаются или исчезают вскоре после начала приема противогрибковых препаратов, важно пройти полный курс лечения. Это увеличивает вероятность того, что микоз стопы не вернется. Реинфекция является распространенным явлением, и микоз стопы необходимо полностью лечить каждый раз, когда появляются симптомы.

Инфекции перепонок пальцев

Инфекции перепонок пальцев (межпальцевые) возникают между пальцами ног, особенно между четвертым и пятым пальцами.Это наиболее распространенный тип инфекции стопы спортсмена.

• Для лечения инфекций перепонок пальцев легкой и средней степени тяжести держите ноги в чистоте и сухости и пользуйтесь безрецептурными противогрибковыми кремами или лосьонами.
• Если развивается тяжелая инфекция, врач может назначить комбинацию противогрибковых кремов для местного применения и антибиотиков для перорального или местного применения.

Инфекции мокасинового типа

Эпидермофития мокасинового типа вызывает шелушение, утолщение кожи на подошве и пятке стопы.Часто ногти на ногах инфицируются (онихомикоз). Инфекцию мокасинового типа лечить труднее, потому что кожа на подошве стопы очень толстая.

• Лекарства, отпускаемые без рецепта, могут не проникать через толстую кожу подошвы достаточно хорошо, чтобы вылечить стопу мокасинового типа. В этом случае можно использовать рецептурные местные противогрибковые препараты, проникающие в подошву, такие как кетоконазол.
• Противогрибковые препараты, отпускаемые по рецепту, иногда необходимы для лечения мокасиновой эпидермофитии стопы.

Везикулярные инфекции

Везикулярные инфекции или волдыри обычно появляются на подъеме стопы, но могут также развиваться между пальцами, на подошве стопы, на верхней части стопы или на пятке. Этот тип грибковой инфекции может сопровождаться бактериальной инфекцией. Это наименее распространенный тип инфекции.

Лечение везикулярных инфекций можно проводить в кабинете врача или дома.

• Вы можете высушить волдыри дома, вымачивая ногу в безрецептурном растворе Буроу несколько раз в день в течение 3 или более дней, пока область волдыря не высохнет.После того, как область высохнет, используйте местный противогрибковый крем, как указано. Также можно накладывать компрессы с раствором Бурова.
• Если у вас также есть бактериальная инфекция, вам, скорее всего, потребуется пероральный антибиотик.

Даже при лечении микоз часто возвращается. Это может произойти, если:

• Вы не принимаете профилактические меры и снова подвергаетесь воздействию грибков, вызывающих микоз.
• Вы не используете противогрибковые препараты в течение указанного периода времени, и грибки не полностью уничтожены.
• Грибки не погибают полностью даже после полного курса лечения.

Вы можете предотвратить появление микоза стопы, если:

• Следите за тем, чтобы ваши ноги были чистыми и сухими.
  • Высушите пальцы ног после купания или купания.
  • Носите обувь или сандалии, которые позволяют ногам дышать.
  • Находясь в помещении, носите носки без обуви.
  • Носите носки для впитывания пота. Меняйте носки два раза в день.
  • Нанесите на ноги тальк или противогрибковый порошок.
  • Дайте обуви проветриться не менее 24 часов, прежде чем снова надеть ее.
• Ношение сандалий для душа в общественных бассейнах и душевых.

Что следует учитывать

Вы можете отказаться от лечения микоза стопы, если ваши симптомы не беспокоят вас и у вас нет проблем со здоровьем, которые увеличивают вероятность тяжелой инфекции стопы, например диабета. Но нелеченный микоз стопы, вызывающий волдыри или трещины на коже, может привести к тяжелой бактериальной инфекции.Кроме того, если вы не лечите микоз стопы, вы можете заразить других людей.

Тяжелые инфекции, возникающие внезапно (острые), обычно хорошо поддаются лечению. Длительные (хронические) инфекции бывает труднее вылечить.

Инфекции ногтей на ногах (онихомикоз), которые могут развиться при эпидермофитии стопы, обычно труднее вылечить, чем грибковые инфекции кожи. Для получения дополнительной информации см. тему Грибковые инфекции ногтей.

Профилактика

Вы можете предотвратить эпидермофитию стоп (дерматомикоз стопы):

• Следите за чистотой и сухостью ног.
  • Высушите пальцы ног после купания или купания.
  • Носите обувь или сандалии, которые позволяют ногам дышать.
  • Находясь в помещении, носите носки без обуви.
  • Носите носки для впитывания пота. Меняйте носки два раза в день.
  • Нанесите на ноги тальк или противогрибковый порошок.
  • Дайте обуви проветриться не менее 24 часов, прежде чем снова надеть ее.
• Ношение сандалий для душа в общественных бассейнах и душевых.

Если у вас микоз стоп, после купания вытирайте насухо паховую область перед ногами. Также надевайте носки перед нижним бельем. Это предотвратит распространение грибков с ног на пах, что может вызвать зуд. Дополнительную информацию о зуде спортсменов см. в теме Кожный стригущий лишай.

Советы по предотвращению рецидивов эпидермофитии стоп

• Всегда заканчивайте полный курс любого противогрибкового препарата (крема или таблетки). Живые грибки остаются на коже в течение нескольких дней после исчезновения симптомов. Шансы убить микоз стопы максимальны, когда вы лечите его в течение установленного периода времени.
• Стирка одежды в мыльной теплой воде может не убить грибки, вызывающие микоз. Используйте горячую воду и отбеливатель, чтобы увеличить вероятность уничтожения грибка на одежде.
• Вы можете помочь предотвратить повторную инфекцию перепонки пальцев, используя присыпку, чтобы держать ноги сухими, используя овечью шерсть между пальцами (для их разделения) и надевая более широкую и просторную обувь, которая не была заражена грибками. Шерсть ягненка доступна в большинстве аптек или магазинов по уходу за ногами.

Домашнее лечение

Обычно вы можете лечить эпидермофитию стоп (дерматомикоз стоп) самостоятельно в домашних условиях, используя лекарства, отпускаемые без рецепта, и заботясь о своих ногах.Но если у вас диабет и развилась эпидермофития стопы или у вас постоянные, тяжелые или рецидивирующие инфекции, обратитесь к врачу.

Лекарства, отпускаемые без рецепта

Противогрибковые средства, отпускаемые без рецепта, включают клотримазол (лотримин), миконазол (микатин), тербинафин (ламизил) и толнафтат (тинактин). Эти лекарства представляют собой кремы, лосьоны, растворы, гели, спреи, мази, тампоны или порошки, которые наносятся на кожу (лекарства для местного применения). Лечение продлится от 1 до 6 недель.

Если у вас везикулярная (пузырчатая) инфекция, замачивайте ногу в растворе Бурова несколько раз в день в течение 3 или более дней, пока не исчезнет жидкость из пузырей. После того, как жидкость уйдет, используйте противогрибковый крем, как указано. Также можно накладывать компрессы с раствором Бурова.

Чтобы предотвратить возвращение эпидермофитии стоп, используйте полный курс всех лекарств, как указано, даже после исчезновения симптомов.

Избегайте использования крема с гидрокортизоном при грибковой инфекции, если это не прописано врачом.

Уход за ногами

Хороший уход за ногами помогает лечить и предотвращать микоз стоп.

• Держите ноги в чистоте и сухости.
  • Высушите пальцы ног после купания или купания.
  • Носите обувь или сандалии, которые позволяют ногам дышать.
  • Находясь в помещении, носите носки без обуви.
  • Носите носки для впитывания пота. Меняйте носки два раза в день.
  • Нанесите на ноги тальк или противогрибковый порошок.
  • Дайте обуви проветриться не менее 24 часов, прежде чем снова надеть ее.
• Носите сандалии для душа в общественных бассейнах и душевых.

Если у вас микоз стоп, после купания вытирайте насухо паховую область перед ногами.Также надевайте носки перед нижним бельем. Это предотвратит распространение грибков с ног на пах, что может вызвать зуд. Дополнительную информацию о зуде спортсменов см. в теме Кожный стригущий лишай.

Вы можете отказаться от лечения микоза стопы, если симптомы вас не беспокоят и у вас нет проблем со здоровьем, повышающих риск тяжелой инфекции стопы, например диабета. Но невылеченная инфекция стопы спортсмена, вызывающая волдыри или трещины на коже, может привести к тяжелой бактериальной инфекции.Кроме того, если вы не лечите микоз стопы, вы можете заразить других людей.

Лекарства

Противогрибковые препараты, которые наносятся на кожу (местно), обычно являются препаратами первого выбора для лечения эпидермофитии стоп (дерматофитии стоп). Они доступны в рецептурных и безрецептурных формах. Лекарства, отпускаемые без рецепта, обычно пробуют в первую очередь.

В тяжелых случаях микоза стопы врач может назначить пероральные противогрибковые препараты (таблетки). Но лечение этим лекарством стоит дорого, требует периодического тестирования на опасные побочные эффекты и не гарантирует излечения.

При лечении микоза стопы важно использовать полный курс препарата. Использование его по назначению даже после того, как симптомы исчезнут, увеличивает вероятность того, что вы убьете грибки и что инфекция не вернется.

Варианты лекарств

Обычно в первую очередь пробуют безрецептурные противогрибковые препараты. К ним относятся клотримазол (лотримин), миконазол (микатин), тербинафин (ламизил) и толнафтат (тинактин).

Противогрибковые препараты, отпускаемые по рецепту, можно попробовать, если лекарства, отпускаемые без рецепта, не помогают или если у вас тяжелая инфекция.Некоторые из этих лекарств являются местными противогрибковыми средствами, которые наносятся непосредственно на кожу. Примеры включают бутенафин (Ментакс), клотримазол и нафтифин (Нафтин). Противогрибковые препараты, отпускаемые по рецепту, также можно принимать в виде таблеток, которые называются пероральными противогрибковыми препаратами. Примеры пероральных противогрибковых препаратов включают флуконазол (Дифлюкан), итраконазол (Споранокс) и тербинафин (Ламизил).

Что следует учитывать

Вы можете отказаться от лечения микоза стопы, если симптомы вас не беспокоят и у вас нет проблем со здоровьем, повышающих риск тяжелой инфекции стопы, например диабета.Но невылеченная инфекция стопы спортсмена, вызывающая волдыри или трещины на коже, может привести к тяжелой бактериальной инфекции. Кроме того, если вы не лечите микоз стопы, вы можете заразить других людей.

Если ваши симптомы не улучшаются после 2 недель лечения или не исчезают после 4 недель лечения, позвоните своему врачу.

Некоторые местные противогрибковые препараты действуют быстрее (от 1 до 2 недель), чем другие местные препараты (от 4 до 8 недель). Все быстродействующие лекарства имеют одинаковые показатели излечения. ^{сноска 1} Быстродействующие лекарства могут стоить дороже, чем медленнодействующие, но вы используете меньше этих лекарств для полного лечения грибковой инфекции. Пероральные противогрибковые препараты обычно принимают от 2 до 8 недель.

Other Treatment

Масло чайного дерева или чеснок (ajoene) могут помочь предотвратить или вылечить грибок эпидермофитии стоп (дерматомикоза стопы). Раствор Бурова полезен при лечении пузырчатой ​​(везикулярной) инфекции.

• Масло чайного дерева является противогрибковым и антибактериальным средством, полученным из австралийского дерева Melaleuca alternifolia .Хотя оно уменьшает количество грибков и связанные с ними симптомы, масло чайного дерева не может полностью убить инфекцию. ^{сноска 2}
• Аджоен представляет собой противогрибковое соединение, содержащееся в чесноке. Иногда его используют для лечения микоза стопы.
• Компрессы или ванночки для ног с раствором Буроу, отпускаемым без рецепта, могут помочь успокоить и высушить пузырчатую (везикулезную) микозную стопу. После того, как пузырчатая жидкость исчезнет, ​​вы можете использовать противогрибковые кремы или противогрибковые таблетки, отпускаемые по рецепту.

Ссылки

Цитаты

1. Кроуфорд Ф. (2009).Эпидермофития стопы, дата поиска июль 2008 г. Онлайн-версия BMJ Clinical Evidence : http://www.clinicalevidence.com.
2. Мюррей М.Т., Пиццорно Дж. Э. Младший (2006). Melaleuca alternifolia (Чайное дерево). В JE Pizzorno Jr, MT Murray, eds., . Учебник натуральной медицины , vol. 1, гл. 104, стр. 1053–1056. Сент-Луис: Черчилль Ливингстон Эльзевир.

Другие работы, консультационные услуги

• Хабиф Т.П. (2010 г.).Опоясывающий лишай стопы Поверхностные микозы. В клинической дерматологии: цветной справочник по диагностике и терапии, 5-е изд., стр. 495–497. Эдинбург: Мосби Эльзевир.
• Хабиф Т.П. и др. (2011). Опоясывающий лишай стопы (tinea pedis). В книге «Кожные заболевания: диагностика и лечение», 3-е изд., стр. 269–272. Эдинбург: Сондерс.
• Вольф К., Джонсон Р.А. (2009). Tinea pedis раздел Грибковые инфекции кожи и волос. В Атласе цветов Фитцпатрика и синопсисе клинической дерматологии, 6-е изд., стр. 692–701. Нью-Йорк: Макгроу-Хилл.

Кредиты

Актуально на: 2 июля 2020 г.

Автор: Healthwise Staff
Медицинский обзор:
Патрис Берджесс, доктор медицины – семейная медицина
Адам Хасни, доктор медицины – семейная медицина
Мартин Дж. Габика, доктор медицины – семейная медицина
Элизабет Т.Russo MD — Терапия
Эллен К. Рох MD — Дерматология

Причины, симптомы, лечение и профилактика

Обзор

Что такое импетиго?

Импетиго (im-pa-TIE-go) — зудящая, иногда болезненная кожная инфекция.

Кто болеет импетиго?

Импетиго обычно поражает детей в возрасте от 2 до 6 лет. Импетиго также может быть у детей старшего возраста и у взрослых.

Вы также можете подвергаться повышенному риску, если:

• Живите в тропическом климате с жарким влажным летом и мягкой зимой.
• Заражение чесоткой.
• Занимайтесь спортом или делайте порезы и царапины.
• Живите в условиях тесного контакта или скопления людей. Инфекции часто случаются с людьми, живущими в одном доме, или с детьми в детских садах.

Как возникает импетиго?

Когда вы получаете порез, укус или царапину, открывающую кожу, бактерии могут проникнуть внутрь и вызвать инфекцию импетиго. Но импетиго может заразить кожу, даже если она не повреждена и не проколота.

Импетиго чаще возникает в теплое время года, когда дети больше находятся на улице.

Где возникает импетиго?

Как правило, первыми признаками импетиго являются язвы и волдыри во рту и носу. Импетиго также может появиться на ногах и руках.

Что такое буллезное импетиго?

Буллезное импетиго — редкий тип импетиго. У него большие волдыри, которые не так легко вскрываются. Часто появляется на шее, туловище, подмышках или в паху.

Насколько распространено импетиго?

Импетиго — наиболее распространенная кожная инфекция у детей в возрасте от 2 до 5 лет.У взрослых это происходит гораздо реже. Ежегодно Staphylococcus aureus , бактерии, вызывающие импетиго, вызывают 11 миллионов инфекций кожи и мягких тканей.

Симптомы и причины

Что вызывает импетиго?

Основной причиной импетиго является бактериальная инфекция. Бактерии обычно попадают на кожу через порезы, царапины, сыпь или укусы насекомых.

В большинстве случаев причиной является Staphylococcus aureus («стафилококковые» бактерии). Иногда его могут вызывать бактерии группы A Streptococcus .Этот тип бактерий также приводит к ангине и лихорадке.

Некоторые штаммы стрептококковых бактерий, вызывающие импетиго, также могут вызывать гломерулонефрит. Это воспалительное заболевание почек может вызывать высокое кровяное давление и кровь в моче.

Заразно ли импетиго?

Импетиго протекает легко, но очень заразно. Вы можете распространять импетиго, вступая в контакт с язвами, слизью или выделениями из носа того, у кого оно есть. Люди также могут распространять импетиго, делясь такими предметами, как полотенца, одежда или другие личные вещи, с инфицированным человеком.

Когда появляются симптомы импетиго?

Как правило, после заражения симптомы проявляются в течение трех дней. Расчесывание язв может привести к распространению инфекции. Симптомы сначала начинаются вокруг рта и носа.

Каковы симптомы импетиго?

Симптомы импетиго включают:

• Один или несколько пузырьков, наполненных гноем, которые легко лопаются, вызывая покраснение и раздражение кожи.
• Зудящие волдыри, содержащие жидкость (желтого или коричневого цвета), которая просачивается и образует корку.
• Распространяющаяся сыпь.
• Кожные поражения (раны) губ, носа, ушей, рук и ног. Поражения могут распространяться на другие части тела.
• Опухшие лимфатические узлы рядом с инфицированным участком.

Если у вас или у вашего ребенка импетиго, вызванное бактериями стафилококка, вы можете заметить:

• Красноватая кожа вокруг красных волдырей, наполненных жидкостью или гноем, которые со временем становятся мутными.
• Волдыри, которые легко лопаются и протекают.
• Сырые, блестящие участки, покрытые струпьями желто-коричневой корки.

Диагностика и тесты

Как диагностируется импетиго?

Лечащий врач может диагностировать импетиго на основании внешнего вида язв. Медицинский работник может взять образец кожи для отправки в лабораторию. Патологи могут выяснить, какие бактерии вызывают заболевание, что может помочь определить правильный антибиотик для использования.

Если вы или ваш ребенок заметили кровь или необычный цвет мочи, немедленно сообщите об этом своему лечащему врачу.

Управление и лечение

Как лечится импетиго?

Антибиотики могут лечить импетиго.Медицинский работник может назначить местные антибиотики для нанесения на кожу. Вашему ребенку может потребоваться пероральный прием антибиотиков (жидкости или таблетки), если болезнь охватывает большую площадь кожи или несколько частей тела.

Примеры лечения антибиотиками включают:

• Мупироциновая мазь для местного применения (Bactroban® или Centany®).
• Пероральные антибиотики, такие как цефалоспорины, клиндамицин (Клеоцин®) и сульфаметоксазол (Бактрим™).

Пройдет ли импетиго самостоятельно?

Импетиго часто исчезает в течение примерно трех недель даже без лечения.Но это может занять больше времени. Пока он не исчезнет, ​​ваш ребенок заразен.

Есть ли осложнения импетиго?

Осложнения возникают редко. В том числе:

• Сыпь, которая распространяется на более глубокие слои кожи.
• Проблемы с почками, называемые постстрептококковым гломерулонефритом.

Профилактика

Можно ли предотвратить импетиго?

Лучший способ предотвратить заражение — оставаться чистым и здоровым. Другие советы, как избежать импетиго:

• Держите руки в чистоте: Регулярно мойте руки.Используйте дезинфицирующее средство на спиртовой основе, если у вас нет мыла и воды.
• Соблюдайте правила гигиены: Регулярно стригите себе (и ребенку) ногти, чтобы не поцарапать их. Чихните в салфетку, а затем выбросьте салфетку. Купайтесь ежедневно (или как можно чаще), особенно детям с экземой или чувствительной кожей.
• Избегайте царапин: Не царапайте порезы и раны. Если ваш ребенок получил порез, царапину или рану, не позволяйте ему расчесывать ее.
• Очистите раны: Очистите порезы, царапины и травмы водой с мылом.Затем нанесите на рану крем или мазь с антибиотиком.
• Содержание постельного белья в чистоте: Стирайте нижнее белье, полотенца и простыни в горячей воде.

Перспективы/прогноз

Каковы перспективы для человека, заболевшего импетиго?

Антибиотики могут вылечить импетиго, но это состояние может вернуться, особенно у маленьких детей. Получение этого один раз не защищает кого-то от повторного получения.

Через какое время пройдут болячки?

Полное заживление язв может занять некоторое время.Хорошая новость: инфекция редко оставляет шрамы.

Как долго импетиго заразно?

Без лечения импетиго может быть заразным в течение нескольких недель. После начала лечения импетиго состояние заразно до:

• Сыпь исчезает.
• Струпья отпадают.
• Вы закончили как минимум два дня приема антибиотиков.

Может ли человек заразиться повторно?

Происходит повторное заражение. Дети особенно склонны расчесывать и вскрывать струпья, что подвергает их более высокому риску повторного заражения.

Жить с

Как мне позаботиться о себе, если у меня импетиго?

Если ваш лечащий врач диагностировал у вас или вашего ребенка импетиго, вам могут помочь следующие советы по лечению:

• Держите раны закрытыми: Перевязывайте раны или носите одежду с длинными рукавами и брюки.
• Принимать все лекарства: Принимать антибиотики на протяжении всего времени, которое мне прописал врач, чтобы предотвратить повторное заражение.
• Оставайтесь чистыми: Осторожно мойте кожу несколько раз в день, используя антибактериальное мыло.Это удалит корки и дренаж.
• Не прикасайтесь к сыпи: Если вы дотронетесь до нее, вымойте руки и пораженный участок водой с мылом.
• Изолировать детей: Если у вашего ребенка импетиго, держите его подальше от других детей, пока он не закончит лечение. Они не должны ходить в школу или детский сад.
• Избегайте горячих ванн и бассейнов: Сыпь может распространиться, если другие люди вступят в контакт с кожей, купальным костюмом или полотенцем вашего ребенка.

Записка из Кливлендской клиники Импетиго — это распространенное кожное заболевание, которое в основном поражает маленьких детей. Симптомы импетиго включают волдыри и красные язвы, которые обычно начинаются вокруг рта и носа. Если вы заметили признаки импетиго, поговорите со своим лечащим врачом. Лечение импетиго обычно заключается в применении антибиотиков перорально или местно (крем). Импетиго очень заразно, поэтому держите детей дома, пока они не примут антибиотики хотя бы два дня. Лекарство снимет сыпь.Чтобы предотвратить импетиго, соблюдайте правила гигиены. Очистите и закройте все порезы или царапины, чтобы они не заразились.

Моделирование и слияние биомиметических сетей везикул с использованием оптического пинцета

Сборка сетей везикул

Сети собирали с использованием оптического пинцета для размещения везикул в определенных местах и ​​с использованием неспецифических глобальных межмембранных сил для обеспечения адгезии мембран. Мы разработали изоосмотическую систему, в которой везикулы, состоящие из 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (ПОФХ) и 1 масс.% 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин- N -(лиссамин родамин B сульфонил) (аммониевая соль) (Rh-PE) может быть уловлен оптическим пинцетом ( λ  = 1070 нм) из-за несоответствие показателя преломления (RI) между внутренней частью каждого пузырька (1,5 M сахарозы; RI = 1,406) и внешней (0,75 M NaCl; RI = 1,342) (подробности см. в дополнительных примечаниях 1 и 2). Везикулы можно было поймать в таких условиях, как 0,4 М сахарозы (внутри) и 0,2 М NaCl (снаружи). В зависимости от размера везикул мы могли перетаскивать отдельные везикулы, просто включая и выключая лазер, при мощности от 80 до 470 мВт на задней апертуре объектива (23–190 мВт на ловушке).Сети были собраны путем осаждения пузырьков, непосредственно примыкающих друг к другу (см. Рис. 1 для схемы экспериментальной установки). Через несколько секунд после контакта мембраны быстро слиплись, застегнувшись от начальной точки контакта, чтобы сформировать пару везикул, соединенных мембранным пластырем, называемым VIM (см. Дополнительный фильм 1).

Схема установки для контролируемой сборки везикулярных сетей пользовательской архитектуры. Присутствие 0,75 M NaCl во внешнем растворе приводило к образованию адгезивных везикул, которыми можно было манипулировать в 3D с помощью оптического пинцета и моторизованного предметного столика.Компоненты системы нарисованы не в масштабе. Везикула = c. Радиус 5 мкм, перетяжка лазерного луча = c. 1 мкм. Масштабная линейка = 10 мкм

Формирование адгезивного участка регулируется балансом между силами Ван-дер-Ваальса притяжения и силами отталкивания, электростатическими, волнообразными и гидратационными силами, которые существуют между двумя мембранами ²⁷ . Хотя POPC является цвиттерионом при нейтральном pH, он имеет небольшой отрицательный заряд ²⁸ , вероятно, из-за ориентации головных групп ²⁹ и слоев гидратации ³⁰ .Присутствие NaCl служило для экранирования электростатического отталкивания мембраны, позволяя доминировать силам притяжения, что приводило к адгезии при контакте. Мы обнаружили, что ниже критического порога 0,2 M NaCl мы больше не могли надежно собирать VIM с четко определенными интерфейсами. Как и ожидалось, более высокие концентрации NaCl привели к увеличению поверхности раздела VIM, а присутствие заряженных липидов увеличило минимальную концентрацию NaCl, необходимую для адгезии (см. Дополнительное примечание 3, Дополнительный рисунок 1 и Дополнительную таблицу 1).

Этот подход можно использовать для сборки крупномасштабных сетей определяемой пользователем геометрии, просто перетаскивая отдельные пузырьки в заданные места (рис. 2а). Например, мы смогли сформировать двумерные сети треугольной, квадратной и пятиугольной геометрии, а также разветвленные сети из трех пузырьков, связанных с центральным узлом. Наша способность манипулировать пузырьками в направлении z позволила нам собирать трехмерные геометрические фигуры, такие как тетраэдры, квадратные пирамиды и трехслойные пирамиды (рис.2б, в). Сети VIM можно было реконфигурировать, поскольку было возможно преобразование между геометриями (рис. 2d и дополнительный фильм 2). Можно было преобразовать цепочку пузырьков из четырех пузырьков в двумерный квадрат, а затем в трехмерный тетраэдр, подняв один из пузырьков над остальными тремя пузырьками.

Контролируемая и реконфигурируемая сборка сетей пузырьков. a Определенное количество везикул было собрано вместе для сборки 2-D сетей различной архитектуры, включая, слева направо, двухкамерную, треугольную, квадратную, пятиугольную и разветвленную геометрию. b Везикулы манипулировали вертикально и откладывали, позволяя собирать трехмерные структуры, включая тетраэдрическую и квадратно-пирамидальную геометрию. c Трехслойная пирамидальная геометрия также может быть сформирована с расположением пузырьков, показанным на схеме справа. d Оптический пинцет использовался для реконфигурации сетей между несколькими геометриями (от линейной к квадратной и к тетраэдрической; стрелки указывают направление движения). Ложные цвета использовались для демонстрации того, что изображения были сняты в разных плоскостях и впоследствии наложены друг на друга.Зеленый канал = нижняя плоскость; розовый канал = верхняя плоскость. Масштабная линейка = 10 мкм для всех изображений. Концентрация NaCl = 0,75 M

Мы могли бы контролируемо транспортировать эти сети в пространстве, захватывая одиночный пузырь и перетаскивая всю прилипшую сеть. Все слипшиеся везикулы двигались синхронно, подтверждая наличие участков слипания и показывая, что сети VIM можно рассматривать как дискретные сборки, которыми можно манипулировать в целом.

Сети можно было разобрать после создания, разбавив концентрацию NaCl ниже критического порога адгезии (рис.3а). Это было достигнуто путем медленной перфузии деионизированной воды через агарозный гель, расположенный над образцом, в течение нескольких минут, при этом полное отделение наблюдалось примерно через 10 минут. 45 мин. Разбавление NaCl от 0,75 до 0,2 M также позволило модулировать морфологию VIM, в частности межмембранный контактный угол и площадь лейкопластыря (рис. 3b). Стоит отметить, что растворение солей вызывает дисбаланс осмотического давления на мембранах везикул и что возникающее в результате увеличение натяжения мембран способствует уменьшению площади межмембранного контакта.

Модуляция сети с использованием концентрации соли. a Сети были демонтированы просто путем снижения концентрации NaCl снаружи путем разбавления водой. Полная отслойка произошла после c. 45 мин. b Длина VIM динамически изменялась путем регулирования концентрации NaCl с течением времени, как показано относительной длиной трех интерфейсов в сети из трех пузырьков. Концентрация соли была снижена с 0,75 M до 0,2 M, а затем увеличена с 0,2 до 0.75 M через 30 мин. Длина интерфейса нормирована относительно радиуса пузырька. Масштабная линейка = 10 мкм для всех изображений

Характеристика и модуляция мембран везикул

меченых липидов, где одна везикула была помечена 1 мас.% флуоресцентного липида Rh-PE, а другая немеченая (рис.4а). Никакой свободной диффузии липидов между везикулами не наблюдалось в течение 80 мин, в отличие от гемислитых мембран, где смешивание во внешнем двухслойном листке можно было увидеть в течение секунд ³¹ , что подтверждает существование двух отдельных адгезивных мембран ³² . Это дополнительно подтверждается получением профиля интенсивности флуоресценции на двух флуоресцентно помеченных слипшихся везикулах (рис. 4b), который показывает пятно адгезии, имеющее двойную интенсивность одиночного бислоя, предполагая наличие двухслойного VIM толщиной (см. Дополнительное примечание 4 и дополнительный рис.2). Было обнаружено, что мембрана VIM в среднем в 1,9 раза выше по интенсивности, чем мембрана без VIM для каждой пары везикул (sd = 0,17; n  = 20).

Структурное расположение ВИМ и зависимость от температуры. a Отсутствие диффузии встроенного в мембрану Rh-PE между компартментами везикул позволяет предположить, что поверхности везикул состоят из двух слипшихся мембран, а не полуслитой диафрагмы. b Это подкрепляется профилем интенсивности флуоресценции в сети из двух везикул (вставка; пунктирная линия), показывающим, что флуоресценция интерфейсной мембраны в два раза выше, чем у внешней мембраны везикул. c Рисунок, показывающий характерные параметры симметричной пары пузырьков, включая радиус пузырька ( r ), контактный угол ( θ ) и длину интерфейса ( l ). d Включение оптического пинцета для захвата везикулы (950  мВт в ловушке; захвачено дно везикулы) вызвало изменение как длины интерфейса, так и контактного угла. e Морфология сети может динамически изменяться путем последовательного применения и удаления ловушки. Это демонстрируется графиком, показывающим изменение длины интерфейса с течением времени при включении и выключении ловушки, где длина интерфейса нормализована по отношению к радиусу пузырька.Меньшие прилагаемые мощности привели к меньшим изменениям длины интерфейса. Масштабные полосы = 10 мкм для всех изображений

Одним из ключевых параметров, связанных с этими структурами, является энергия адгезии между отдельными везикулами, которая определяется суммированием сил между везикулами ²⁷ . Чистую энергию адгезии ( Вт ) можно вывести без доступа к вкладам отдельных компонентов, просто используя контактный угол между мембранами двух сфероидальных везикул ( θ ; рис.{\ гидроразрыва {1} {3}} $ $

(1)

Контуры VIM и краевые углы были извлечены с использованием сценария анализа изображений MATLAB (дополнительное примечание 6 и дополнительный рисунок 3), а значение для K , равное 213 мДж м ⁻² , получено из литературы ^34,35 . Энергия адгезии при комнатной температуре была определена равной 0,9 мДж м ^-2 (s.d. = 0,3 мДж м ^-2 ; n  = 20), подобно тому, что было получено в других системах ^{27,35,36 .}

Морфологию пары везикул можно динамически настраивать, изменяя мощность применяемого лазера, что, в свою очередь, влияет на локальную температуру ³⁷ . По мере его увеличения площадь мембраны расширяется, тем самым уменьшая напряжение мембраны и способствуя расширению площади контакта. Однако изменение температуры также влияет на модуль расширения ^38,39 и межмолекулярные силы, которые определяют чистую энергию адгезии ²⁵ , что затрудняет априорное предсказание зависимости площади адгезии от температуры.При локальном нагреве ВИМ с помощью лазера, направленного на центр одной из везикул (0,95 Вт на ловушку), экспериментально наблюдалось увеличение длины интерфейса с 9 до 15 мкм и увеличение краевого угла с 22,8° до 37,1° ( Рис. 4г). Эти значения можно было модулировать, изменяя мощность применяемого лазера (рис. 4e). Мы могли переключаться между морфологиями, просто включая и выключая лазерный источник, при этом преобразование между двумя конфигурациями происходило за секунды, поскольку характерное время рассеивания тепла в воде меньше 1 мс в масштабе длины везикул (рис.4д). Локальное повышение температуры из-за подаваемой энергии лазера оценивается в 9 ° C (дополнительное примечание 8 и дополнительная таблица 2). Аналогичные результаты были получены, когда везикулу нагревали с помощью нагревательного столика, а не с помощью лазера, что также позволяет предположить, что это температурно-опосредованный эффект (дополнительная рис. 5A).

Стоит отметить, что площадь контакта между двумя везикулами одинакового размера во время модуляции оставалась плоской, несмотря на то, что ловушка находилась в центре одной из везикул, а не располагалась симметрично между двумя везикулами.Это говорит о том, что оптический пинцет не вызывал несоответствия механических свойств везикул, что исключает любой эффект оптического растяжения на равновесную морфологию VIM. Кроме того, аналогичная модуляция морфологии VIM, хотя и в более узком диапазоне, также может быть достигнута, когда улавливающий луч располагался на расстоянии нескольких микрон от везикул, причем последние больше не были захвачены оптическим путем (дополнительное примечание 8 и дополнительный рисунок 5B). .

Вторым ключевым параметром, который необходимо определить, является расстояние между слипшимися мембранами.Это было получено путем получения малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) многопластинчатых стопок POPC с 0,75 M NaCl (дополнительный рисунок 6), выявляющего d-расстояние 6,9 нм. Вместе со значением толщины бислоя POPC, равным 3,8 нм (2 _zP , расстояние между головными группами ПК), полученным из литературы ⁴⁰ , было рассчитано межмембранное расстояние 3,1 нм. Эти значения не будут идентичны в прилипших пузырьках, но, вероятно, будут сопоставимы (дополнительное примечание 9). В прилипших везикулах неровности затухают из-за растяжения мембраны, что также может привести к гидрофобным притяжениям в бислоях из-за экспонированного гидрофобного ядра ²⁷ .Кроме того, бислои POPC, по оценкам, утолщаются до 2 Å в присутствии соли ⁴¹ , что еще больше уменьшит предполагаемое межмембранное расстояние. Таким образом, полученное межмембранное значение, вероятно, будет значением верхней границы, поскольку оно игнорирует эти соображения.

Соединение на больших расстояниях с помощью липидных нитей

В дополнение к соединению отсеков, непосредственно прилегающих (несколько нм) друг к другу, мы также смогли сформировать связи , которые физически соединяют два химически различных пузырька на больших расстояниях в пространстве (сотни микрон) .Были и предыдущие примеры контролируемого образования привязи между шариками и пузырьками ^42,43 с использованием ловушек, но здесь мы формируем привязи между несколькими пузырьками.

После образования, если оставить ВИМ для осаждения на субстрате для покровного стекла, не пассивированном бычьим сывороточным альбумином (БСА), можно наблюдать стохастическую адгезию везикул на поверхности. Таким образом, второй неприлипший везикул можно было перемещать с помощью оптического пинцета, в то время как партнер оставался неподвижным. Удивительно, но при этом не наблюдалось полного разрыва лоскута спайки.Вместо этого, когда везикулу вытягивали, было обнаружено, что площадь спайки уменьшалась до определенного момента, когда между двумя везикулами появлялась соединительная связь (рис. 5, дополнительное примечание 7 и дополнительный рисунок 4).

Связывание пузырьков на большие расстояния с помощью тросов. a Привязи между двумя везикулами образовывались, когда один везикул тянулся относительно другого стационарного везикула, прикрепленного к поверхности. Белая стрелка указывает направление вытягивания. Маркировка каждой везикулы другим флуорофором (Rh-PE = фиолетовый; NBD-PE = синий) демонстрирует существование двух субсвязей, по одной от каждой везикулы, которые встречались в середине и закреплялись на субмикронной адгезии. b Точное расположение точки крепления (желтая стрелка) можно было изменить, удлинив привязь, потянув за везикулу. Пунктирные белые кружки обозначают расположение нефлуоресцентного пузырька. Масштабная линейка = 10 мкм для всех изображений

Эту привязь можно тянуть на сотни микрон, не разрывая. Разрыв троса никогда не наблюдался, и увеличение скорости, с которой натягивали трос, приводило к тому, что везикула выходила из оптического пинцета, демонстрируя, что оптические силы никогда не превышают силу сцепления троса с тросом или силу разрыва троса.После высвобождения везикулы путем отключения ловушки привязь втягивалась, и VIM формировал спаечный пластырь, процесс, который можно было повторять несколько раз. Эти привязки были закрыты, о чем свидетельствует отсутствие диффузии инкапсулированного кальцеина и встроенных в мембрану флуоресцентных липидов Rh-PE между отсеками в течение 20 минут (дополнительное примечание 10 и дополнительный рисунок 7). Это говорит о том, что существует крошечный адгезивный участок, удерживающий связки вместе, подобный тем, которые обнаруживаются, когда связки формируются из меченых стрептавидином шариков и биотинилированных везикул ⁴³ .

Маркировка одной везикулы флуоресцентным липидом позволила нам найти точку привязки между мембранами. Это привело к поразительному наблюдению, что в большинстве случаев привязь состояла не из мембраны только одного пузырька, а действительно состояла из обеих, с мембранами, встречающимися около средней точки привязи (рис. 5a и дополнительный фильм 3). В тех случаях, когда точка крепления располагалась асимметрично вдоль троса (т.5б).

Уникально то, что созданные нами связи удерживаются вместе неспецифическими глобальными силами, в отличие от специфических молекулярных сил, таких как биотин/стрептавидин или взаимодействие пар оснований ДНК. Одна гипотеза состоит в том, что формирование привязей управляется компромиссом между энергетическими потерями при разрыве участка мембраны и деформацией области мембраны. Первоначально, при большом пятне спайки VIM, натяжение троса требует больших энергетических затрат, поскольку деформации может противостоять поверхностное натяжение.Таким образом, заплата уменьшается в размере до точки, в которой она становится достаточно маленькой, чтобы затраты энергии на натяжение троса были ниже, чем при разрыве оставшейся адгезивной заплаты.

Взаимодействие везикул

Одним из больших обещаний компартментализованных агрегатов мягкой материи везикул является перспектива их использования в качестве реакционных сосудов пиколитр/фемтолитров, а также в качестве тканеподобных клеточно-миметических компартментов в синтетической биологии. Чтобы понять это, необходимо продемонстрировать связь и передачу материала между отсеками.Это создает проблемы в системе VIM, т.к. наличие двойной мембраны на интерфейсах препятствует использованию одиночных трансмембранных белковых пор в качестве проводников между компартментами.

Чтобы решить эту проблему, мы используем белок поры альфа-гемолизин (α-HL; диаметр пор 1,4 нм) и полагаемся на диффузию через две поры, одна из которых позволяет материалу покинуть донорский везикул в межмембранное пространство, а вторая чтобы позволить ему диффундировать из этого пространства в акцепторный пузырь. Однако, поскольку α-HL встраивается во все мембраны — как на поверхности везикул, так и обращенные к внешнему раствору, — нам приходилось избирательно блокировать каналы, не лежащие в межмембранной области, чтобы предотвратить утечку груза во внешнюю среду.Это было достигнуто путем добавления блокатора циклодекстрина (гептакис(2,3,6-три-О-метил)-β-циклодекстрин; TRIMEB) во внешний раствор, который нековалентно закупоривает поры α-HL ⁴⁴ , тем самым снижая утечка материала наружу ^45,46 . Важно отметить, что, поскольку блокатор немного больше, чем межмембранное расстояние (максимальное расстояние между точками около 4 нм) ⁴⁷ , его способность проникать в это пространство снижается, что позволяет избирательно перемещать материал между компартментами.Хотя α-HL может диффундировать из области VIM, при этом он сталкивается с блокаторами, присутствующими во внешнем растворе, препятствуя утечке инкапсулированного материала.

Чтобы подтвердить успешную работу этой системы, мы провели анализ утечки флуоресценции (рис. 6) между двумя везикулами, содержащими α-HL (50 нг мкл ^-1 ) внутри, сформированными с помощью метода переноса эмульсии. Донорский везикул был нагружен Ca ²⁺ (200 мМ), акцепторный везикул — чувствительным Ca ²⁺ красителем Fluo-4 (0.54 мМ) и ЭДТА (1 мМ) для минимизации фоновой флуоресценции с TRIMEB (10 мМ) снаружи (схему см. на рис. 6а). После переменной лаг-фазы продолжительностью до 4 мин (дополнительное примечание 11 и дополнительный рис. 8) флуоресценция акцепторного отсека увеличивалась по мере того, как Ca ²⁺ диффундировал через поры, до тех пор, пока сигнал не стал насыщенным через ок. 5 мин (рис. 6б, в). В контрольных измерениях не наблюдалось увеличения флуоресценции при отсутствии белка или блокатора из-за утечки Ca ²⁺ наружу.Точно так же флуоресценция не увеличивалась, когда снаружи отсутствовал NaCl, но внутри присутствовали α-HL и TRIMEB. Везикулы контактировали, но ВИМ не образовывался. Этот результат указывает на то, что там, где наблюдалась успешная коммуникация между везикулами, Ca ²⁺ не диффундировал в основную массу, а затем обратно в соседние везикулы. Мы также провели эксперименты по высвобождению флуоресценции на отдельных везикулах, чтобы продемонстрировать эффективность блокатора в предотвращении утечки ионов во внешнюю среду, и результаты показали, что это действительно замедлило скорость в пять раз (дополнительное примечание 12 и дополнительный рисунок.9). Следует отметить, что в системе, вероятно, существует остаточный уровень негерметичности за счет выхода вещества через межмембранное пространство и вследствие несовершенной блокировки пор через наружные мембраны.

Межпузырьковое сообщение. a Схема инженерной системы, позволяющей инкапсулированному содержимому (Ca ²⁺ ) селективно перемещаться через две последовательные белковые поры в соседний компартмент, содержащий чувствительный краситель Ca ²⁺ (Fluo-4).Утечка ионов через наружные мембраны подавляется наличием блокаторов каналов, обладающих пониженной способностью проникать в межмембранное пространство. b Светлопольные и флуоресцентные изображения пары прикрепленных везикул, демонстрирующие успешную коммуникацию, при этом флуоресценция везикул, содержащих краситель, со временем увеличивается. Пунктирные желтые линии обозначают границы пузырьков. c График интенсивности флуоресценции в отсеке, содержащем краситель, в зависимости от времени.Столбики погрешностей представляют стандартное отклонение ( n  = 5). Масштабная линейка = 10 мкм для всех изображений

Слияние везикул

Путем небольшого изменения нашей экспериментальной системы стало возможным использовать оптический пинцет для слияния выбранных отсеков в сети VIM, операция, которая может выполняться с высоким временным и пространственным разрешением . Для этого мы прикрепили наночастицы золота (AuNP) размером 150 нм на внешней поверхности везикул с помощью конъюгации биотин/стрептавидин (рис. 7а, б). Когда они попадают в фокус лазера, они поглощают энергию, которая рассеивается в виде тепла, что приводит к экстремальному повышению температуры (>100 °C при использовании наших рабочих мощностей) ⁴⁸ .Это локализованный эффект с рассеиванием тепла, происходящим в масштабе длины, сравнимом с наночастицами ⁴⁸ . Нарушения мембранной ткани (возможно, из-за расширения мембраны и открытия поры слияния) ⁴⁹ было достаточно, чтобы привести к разрушению VIM и слиянию отсеков при достаточно высоких мощностях (> 150   мВт в ловушке; см. Дополнительный фильм 4 ) ^49,50 . Слияние было завершено через несколько секунд после фокусировки лазера на VIM. В качестве альтернативы можно также использовать 80-нм AuNP, хотя мощность, необходимая для последовательного достижения слияния, была выше (> 300 мВт в ловушке) ⁴⁸ .С AuNP размером 1–2 нм сплавление не наблюдалось, вероятно, из-за коротких расстояний рассеивания тепла и из-за того, что они не резонируют на длине волны улавливающего лазера. Добавление кальцеинового красителя (50  мМ) к одному везикулу и флуоресцентно-меченого липида (Rh-PE) к другому показало, что и просвет везикулы, и сама мембрана были полностью перемешаны после слияния (рис. 7c). Возможность изменения состава мембран слитых GUV была продемонстрирована путем слияния двух GUV с разными липидами с флуоресцентной меткой (Rh-PE и NBD-PE; рис.8а). Расположение AuNP на мембране до сих пор неизвестно. Если частица действительно находится в межмембранном пространстве, она может образовать биотин/стрептавидиновый мостик между везикулами. Однако, поскольку добавление AuNP не оказывает существенного влияния на размер пятна адгезии (дополнительное примечание 13 и дополнительный рисунок 10), этот эффект не считается значительным.

Опосредованное AuNP слияние везикул. a Схема везикулы, меченой AuNP. b Химическая структура биотинилированного липида. c Схематическое и флуоресцентное микроскопическое изображение слияния VIM. Везикула, меченная Rh-PE (желтый канал), сливается с кальцеинсодержащей везикулой (зеленый канал) с применением лазера (белая точка) в VIM (белая стрелка), чтобы получить везикулу, несущую как флуоресцентный липид, так и флуоресцентный груз. Масштабная линейка = 5 мкм для всех изображений

Слияние сети везикул и смешивание материала. a Схематические и флуоресцентные изображения везикул, меченных Rh-PE (желтый) и NBD-PE (зеленый), слитых с образованием везикулы большего размера, содержащей оба липида. b Сеть из четырех пузырьков, где каждое соединение пузырьков по очереди разрывается лазером, демонстрируя пространственный контроль процесса. c Разбавление как груза (кальцеин; зеленый), так и мембранного материала (Rh-PE; желтый) везикул путем последовательного слияния с двумя пустыми везикулами (белые пунктирные кружки). На графике показана средняя интенсивность флуоресценции груза и мембраны (столбики погрешностей = 1 sd; n  = 10). Белые стрелки показывают VIM, выбранный для объединения. Масштабные полосы = 5 мкм для всех изображений

Поскольку слияние с термическим запуском было локализовано в лазерном пятне, мы смогли построить сеть VIM и специально выбрать один дискретный VIM для слияния.Например, мы сформировали сеть из четырех везикул, сливая каждый из VIM по очереди, пока не остался только один большой везикул (рис. 8b). Этот подход позволил нам выполнить последовательное разведение как материала липидной мембраны, так и инкапсулированного материала везикулы, содержащей груз. Везикула, помеченная 1 мас.% флуоресцентным Rh-PE и инкапсулированным кальцеином (50 мМ), была слита с двумя другими нефлуоресцентными везикулами в сети VIM (рис. 8c). Каждое событие слияния приводило к снижению интенсивности флуоресценции инкапсулированного материала и мембраны грузового отсека.

Затем мы продемонстрировали способность проводить контролируемую биохимию в везикулах, используя их как клеточные реакторы. Мы выделили компоненты, необходимые для сопряженной бесклеточной транскрипции и трансляции, в трех отдельных компартментах сети VIM, а затем инициировали синтез белка с помощью лазера (рис. 9). Мы использовали систему экспрессии белка PURExpress, восстановленную из очищенных клеточных компонентов ⁵¹ , плазмиды GFP и сети из трех пузырьков для этих экспериментов.Одна везикула содержала тРНК, аминокислоты и рНТФ (раствор A PURExpress). Второй содержал рибосомы, РНК-полимеразу Т7, факторы трансляции, аминоацил-тРНК-синтетазы и ферменты регенерации энергии (раствор B PURExpress). Третий содержал плазмиду. Чтобы оптически различить популяции везикул, два типа везикул были помечены Cy5-PE и Rh-PE (филеры Cy5 и TRITC), а третий остался немеченым. Сеть везикул (5 ± 2 мкм в диаметре каждая) формировали наружно с 0,25 М NaCl и 0.5 M сахарозы внутрь. Три отсека были объединены, и экспрессия GFP наблюдалась с течением времени (фильтр FITC; экспозиция 1 с). Продукция GFP была обнаружена через 20 мин после слияния, при этом реакция продолжалась ок. 100 мин до выхода на плато (рис. 9b). Эти результаты свидетельствуют о том, что условия с высоким содержанием солей, необходимые для образования ВИМ, не препятствуют проведению биохимических реакций внутри везикул из-за экранирующего эффекта липидной мембраны. Изменчивость результатов (дополнительное примечание 13 и дополнительный рис.11), вероятно, из-за изменчивости как объемов везикул, так и эффективности инкапсуляции отдельных компонентов в бесклеточной смеси для экспрессии ^52,53 .

Слияние везикул для инициации биохимических реакций в клеточно-миметическом компартменте. a Схематическое и флуоресцентное микроскопическое изображение сети из трех пузырьков, содержащей различные компоненты, необходимые для бесклеточной экспрессии белка. Красный = липид Cy5-PE, желтый = липид Rh-PE. Пунктирный белый кружок представляет собой немеченый везикул.Везикулы сливали с помощью лазера, что приводило к синтезу GFP (зеленый канал). Масштабная линейка = 5 мкм для всех изображений. b График, показывающий увеличение средней флуоресценции после слияния по мере синтеза GFP (столбики погрешностей = 1 s.d, n  = 5)

семенные пузырьки | анатомия | Британика

семенной пузырек , одна из двух удлиненных мешковидных желез, которые выделяют свое жидкое содержимое в семяизвергающие протоки некоторых самцов млекопитающих.

На два семенных пузырька приходится примерно 60 процентов жидкости, выделяемой мужчиной во время эякуляции ( q.т. ). У некоторых млекопитающих вместимость семенных пузырьков значительно больше; кабан, например, может выделять в 50 раз больше семенной жидкости. Хищные, сумчатые, однопроходные и китообразные не имеют семенных пузырьков.

Британская викторина

Человеческое тело: правда или вымысел?

Насколько глубоки ваши знания о внутреннем устройстве человека? Проверьте это с помощью этого теста.

Секрет семенных пузырьков составляет основную часть семенной жидкости (спермы). Это густая жидкость, содержащая сахарную фруктозу, белки, лимонную кислоту, неорганический фосфор, калий и простагландины. Как только эта жидкость соединяется со спермой в эякуляторном канале, фруктоза действует как основной источник энергии для сперматозоидов вне тела. Считается, что простагландины способствуют оплодотворению, делая слизистую оболочку шейки матки более восприимчивой к сперме, а также помогая движению сперматозоидов к яйцеклетке при перистальтических сокращениях матки и фаллопиевых труб.

У половозрелого мужчины семенные пузырьки представляют собой удлиненные тела длиной от 5 до 7 см (от 2 до 2,75 дюймов) и шириной от 2 до 3 см. В каждом пузырьке есть трубочка длиной 15 см, сильно извитая и извитая; эту трубку окружает соединительная ткань (кровеносные и лимфатические сосуды, нервные волокна и поддерживающая ткань). Сам каналец состоит из трех слоев: внутренней оболочки, влажной и складчатой ​​слизистой оболочки; мышечный слой продольной и циркулярной ткани; и волокнистое наружное покрытие из эластической ткани.Слизистая оболочка выделяет жидкости, выделяемые семенными пузырьками; он сильно сложен, когда трубка пуста, и может без травм растягиваться, когда ее выделения заставляют ее заполнять трубочку. Во время эякуляции мышечная ткань и эластические волокна сокращаются, чтобы вывести содержимое пузырька в эякуляторные протоки вскоре после того, как семявыносящие протоки опорожнили сперму в эти протоки.